數字PCR緣何是PCR的未來？群雄逐鹿，幾分天下？

　　新冠疫情之下，“測核酸”已成為全民熱詞，PCR作為測核酸的官宣儀器也火爆熱賣，這里指的是熒光定量PCR（qPCR）。大家知道，有時的“漏檢”是因為病毒的copy數太低；而若想減少甚至消除“漏檢”，可用另一種更靈敏更精準的數字PCR（digital PCR，dPCR）技術。dPCR和qPCR到底有何區別？為什么說dPCR的效果更好？它能解決哪些問題？國內外有哪些dPCR的玩家？本文將揭秘dPCR的前世今生，并對市場上dPCR的代表性產品逐一展示，希望能為您下次入囊前做點兒準備。

PCR定量發展簡史

　　PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction），它以DNA雙鏈復制原理為基礎，對特定核酸樣本進行體外擴增，能夠將微量的核酸樣本迅速拷貝至幾百萬倍。自1985年美國科學家Kary Mullis發明PCR以來的三十多年，PCR經歷了三代技術的發展。第一代傳統PCR技術，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產物進行定性分析；第二代熒光定量PCR（qPCR）技術，通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監控PCR進程，最后用進入擴增指數期時的Cq值（羅氏）或Ct值（AB/賽默飛）對基因進行定量分析。

　　為何第一代PCR只能定性？這是因為PCR反應事實上呈現S型，在反應終點區測定終點產物的數量誤差很大，因此只能定性。第二代qPCR利用拐點產物數量定量，重現性好，當結合標準曲線后，可以實現絕對定量。這同分析化學上講的定量方法并無區別，實現定量，需要找到標準樣品，需要做標準曲線。

　　圖1 利用拐點產物數量進行定量的實時熒光定量PCR

　　圖2 實時熒光定量PCR實現絕對定量

　　下面我們重點說說神奇的第三代數字PCR（dPCR）技術，這種定量技術，既不需要標準品，也不需要做標準曲線，即可實現對起始樣本的絕對定量，靈敏度和準確度還特別高。縱觀當今分析技術，唯有dPCR可以實現不需標準曲線的絕對定量，足可笑傲定量江湖，用降維打擊、一舉封神、YYDS等各種贊譽來形容它都挺合適。

　　dPCR的基本原理是：通過將PCR反應液進行有限稀釋，實現核酸分子的單分子擴增，最終采取終點法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1；沒有熒光信號的微滴判讀為 0，因此該技術被稱為數字PCR。簡而言之，就是把復雜的定量工作簡化成“1”和“0”，沒有尋找標準品的困擾，沒有做標準曲線的煩惱，把所有人為誤差統統丟掉，這就是dPCR被譽為PCR技術之未來的底氣。

　　數字PCR的誕生

　　1992年，Sykes等在檢測復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因時，利用樣品的有限稀釋，讓每個微孔只獲得單個模板分子，通過計算PCR后的擴增信號，以期準確確定原始分子的數量，雖然沒有明確提出“數字PCR”的概念，但是已經建立了數字PCR基本的實驗流程，并且確定了數字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”作為定量方法，這是數字PCR的雛形。1999年，霍普金斯大學的Bert Vogelstein和他的同事Kenneth Kinzler等在分析癌癥突變的罕見基因型過程時，因受到體細胞基因的干擾，而遇到檢測靈敏度和檢測分辨率的瓶頸，采用了在384孔板中對每個反應孔的樣品量進行極限稀釋并增加反應孔數進行檢測的方式，從而明確提出了數字式PCR的概念，同時也提出如果采用更多孔板其檢測靈敏度會更高，從而指出了dPCR系統的發展方向。

　　dPCR是PCR技術上里程碑式的飛躍，其概念被提出后，受限于當時的技術條件，如樣本稀釋及分配都是靠手工來完成的，干擾和限制因素較多；并且結果分析對于研究者來說也十分枯燥與繁瑣，因此在很長一段時間dPCR發展停滯不前。后來由于微流控技術與微納集成制造工藝的發展解決了dPCR應用過程中的幾個關鍵技術問題，推動了dPCR的研究與商業化的發展。

　　細說dPCR原理

　　數字PCR的基本原理是：將稀釋的核酸樣品分配到大量獨立的微反應單元，進行大規模單拷貝PCR擴增反應和基于泊松分布（Poisson distribution）的絕對定量分析。與RT-qPCR不同，dPCR不需要使用標準曲線，即可實現目的核酸拷貝數的絕對定量。dPCR平臺是基因和細胞治療的標配，在載體開發中可以用作質量控制檢測。

　　目前根據dPCR樣本稀釋分配的方式，基本可分為三大類，一種是基于大規模集成的微流控芯片；第二種是使用微反應室/孔板；第三種是基于液滴式。其中后者是近年來dPCR分析儀的主流。液滴數字PCR（ddPCR）是一種基于水油乳液液滴技術的dPCR方法，其將樣品分餾成20,000個液滴，并在每個液滴中發生模板分子的PCR擴增。ddPCR 技術使用的試劑和工作流程與大多數基于TaqMan探針的標準檢測有著相似的試劑和工作流程。大規模樣本分區是dPCR 技術的一個關鍵方面，不論是芯片式還是液滴式，其基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或者液滴當中，每個反應器的核酸模板數少于1或者等于1。經過PCR擴增之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，可以推算出原始溶液的核酸濃度。

圖3 液滴dPCR檢測原理

　　數字PCR的主要技術特點

　　dPCR具有靈敏度高（可達0.001-0.0001%），特異性強，可檢測復雜背景下的靶標序列；可高度耐受PCR反應抑制劑，如SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Heparin（肝素，血液抗凝劑）等；不必依賴對照品或標準品，可對目標拷貝數直接進行精確定量，分析微小的濃度差異；實驗數據分析便捷，每個微滴的檢測結果以陰性、陽性判讀，數據分析自動化；可統計突變率，通過統計分析可得出靶點的突變率。

　　作為近年來興起的分子診斷分析技術，dPCR在應用技術上還存在需要改進的地方，如通量較低，一般單個反應2重反應效果最佳；dPCR優點是靈敏度高，但是對于DNA濃度大的樣本來說優勢就不能體現，而且核酸濃度高時，每個微滴里面包含的拷貝數不符合泊松分布；dPCR雖然不依賴標準曲線，但是每次反應之間存在差異，短期內不能完全取代qPCR，也不能代替其他金標準方法。

數字PCR儀在細分領域的應用前景

　　dPCR技術的出現不是為了完全取代原有分子診斷技術，而是更好的補充和完善現有技術平臺。dPCR為不同應用場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路，尤其是在醫學檢驗方面，在感染性疾病早期檢測、癌癥的液體活檢、無創產前檢查等領域展現出良好的應用前景。

　　dPCR的優勢與臨床應用前景已在許多研究中得到確認，但最終實現在臨床上的廣泛應用，需要以下幾個方面進行升級：商用dPCR系統需要進一步提升樣本檢測通量以充分滿足病毒篩查的需求；需要制定國家或行業統一標準。目前新羿生物已經推動了dPCR的地方標準（DB 32/T3762.16-2001 新型冠狀病毒檢測技術規范第16法：核酸數字PCR），用于新冠病毒檢測；需要產業界進一步降低設備成本；基于dPCR的新冠檢測試劑盒需要經過嚴格評價，并獲得NMPA、FDA、CE等監管機構的認證才可投放國內或海外市場。

　　實現感染性疾病早期高效檢測——以新冠病毒為例

　　（1）病毒檢測。qPCR檢測技術是目前新冠病毒檢測的“金標準”，但由于病毒探針結合位點突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測過程中經常出現假陰性結果，由于dPCR具有更高的靈敏度、精準度，以及其適合痕量樣本檢測的特性，能夠糾正RT-qPCR檢測出的“假陰性”結果，作為后者的補充方法。

　　（2）臨床樣本病毒載量評估。在人群篩查及臨床診療中，為科學選取采樣方式，需要評估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于dPCR可提供絕對量化指標，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。

　　（3）監測環境病毒載量。在外防輸入的戰略要求下，環境病毒檢測尤為重要。dPCR可對低核酸豐度樣本進行有效檢測，包括從不同環境中取樣的樣本，如病房、衛生間、實驗室等等，在疫情防控中起到了不可忽視的作用。此外，dPCR的應用場景還有病程不同階段的病毒載量評估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發等環節。

　　助力癌癥液體活檢——實現患者全病程監控

　　液體活檢是普通癌癥檢測的延伸和補充方法，將目標采取樣本從組織延伸到血液、體液。dPCR可精確檢測轉移到血液循環中的腫瘤細胞和DNA片段，提供基因突變情況等信息，動態監控病人病程的發展，從而為伴隨診斷和個性化治療提供可靠依據。

　　高效篩查胎兒疾病——提高無創產檢普及性和依從性

　　通過無創產前檢查，針對胎兒染色體非整倍體異常、遺傳性基因疾病等進行風險評估。目前，大多數商品化的無創產前檢查產品都是基于二代測序的技術和平臺，該方法檢測周期長（1-2周出報告）、技術門檻高、檢測費用高，阻礙了該技術的廣泛應用。而基于dPCR的無創產前檢測技術有望實現準確、快速、簡便的產前篩查。

數字PCR的市場分布及預測

　　全球市場分布和預測

　　目前數字PCR市場規模并不大，全球約1.5億至2.5億美元，占實時定量熒光PCR市場總規模(約20億美元)的10%，但增長趨勢顯著，有望在技術成熟后與目前的qPCR平分江山，甚至逐步替代qPCR技術。

　　研究報告預測，2019-2024年全球qPCR和dPCR市場將以8.8%的年復合增長率增長，從2014年的41.13億美元增長到2024年的62.7億美元。其中，dPCR的增速更快達11.9%，將從2014年的4.75億美元，增長到2024年8.34億美元；qPCR的年增速為8.37%，從2014年的36.28億美元，增長到2024年的54.37億美元。這個預測沒有料及2020年新冠疫情的爆發，為PCR檢測帶來極大的市場。但圖4的發展趨勢還有參考價值。

圖4 2017年-2024年dPCR全球增長情況預測

　　從市場的角度來看，北美依然是dPCR最大的主導市場，其次是亞洲和歐洲。北美市場增長是由于北美地區存在慢性病的高患病率和完善的醫療保健基礎設施等。此外，有利的政府舉措和研究伙伴關系數量的增加，是預計市場增長的驅動因素。

圖5 dPCR全球市場分布

　　把企業類型分為三檔，其中第一檔為收入大于10億美元企業。第二檔為1億至10億美元，第三檔為小于1億美元，分別占有45%，34%，21%，這說明該行業存在巨頭，但是尚未形成壟斷，對于相對其他企業仍有機會。dPCR由幾個主要公司占據一半的全球市場，包括Bio-Rad Laboratories Inc.，Thermo Fisher Scientific，Fluidigm Corporation，QIAGEN，Sysmex Corporation，JN Medsys，Merck KGaA，Stilla和Avance Biosciences等。

圖6 液滴dPCR在癌癥細分市場的應用

　　ddPCR是近年來PCR的主流技術，推動細分市場增長的因素是癌癥，傳染病的患病率增加以及檢測中心資金的增加。

　　中國市場分布和預測

　　在精準醫療、個性化用藥等需求推動下，分子診斷技術在全球得到飛速發展。我國dPCR行業一直保持著穩定快速的增長。根據沙利文(Suvillian)數據顯示，中國dPCR行業市場規模從2013年的14.6億元增加至2017年的72億元，年復合增長率CAGR=29.2%，到2022年市場規模預計將達到266.6億元人民幣。

　　圖7 數字PCR市場規模預測（億元）

　　（資料來源：Frost&Suvillian，國元證券研究中心）

　　國內dPCR行業市場規模持續快速增長，主要受到精準診斷需求增加、技術突破增加利潤、國家政策支持（國產替代）等因素影響，未來dPCR將會有更大的發展空間，這是因為（1）人口增長與老齡化：我國人口老齡化趨勢導致腫瘤醫藥市場增長和體外檢測需求增長，而dPCR在腫瘤檢測、傳染病檢測、遺傳病等疾病檢測上優勢明顯，醫療市場的擴容將進一步推動dPCR的增長；（2）國內政策利好：根據國家科技部辦公廳發布的《“十三五”醫療器械科技創新專項規劃》，要求重點開發POCT檢測、新型基因測序儀、隨檢全自動核酸檢測系統、定量dPCR等系統；（3）精準醫療與腫瘤治療需求：精準醫療的基礎在于個體化醫療，對致病突變檢測和定量分析的精確性要求較高，亟需新一代PCR技術的應用，而數字PCR在這方面優勢明顯。

數字PCR的主要產品

　　自2006年，Fluidigm公司推出第一個商業化的基于芯片的dPCR儀以來，數字PCR儀不斷實現創新和突破。在稀釋方式上，主要的是伯樂為代表的液滴式、以Fluidigm、賽默飛為代表的芯片式和羅氏、凱杰為代表的微板式。國外dPCR主要是三個模塊組成的一體機，而國內大多還是幾臺儀器分別完成樣本分區、擴增和數據讀取。新冠疫情下，dPCR生產商無不在產品上實現突破，近年來新品頻出，直有問鼎分子診斷之勢。

　　Bio-Rad（伯樂）

圖8 伯樂QX ONE ddPCR系統

　　擁有二十多年PCR儀研發、生產經驗的伯樂公司是全球dPCR市場的領跑者。伯樂于2011年斥資1.62億美元，完成對QuantaLife公司的收購，正式進軍dPCR市場，隨即推出QX100、QX200微滴式數字PCR系統以及最新的QX One集成液滴數字系統。2017年，伯樂又收購了ddPCR系統制造商RainDance Technologies，該公司擁有在短時間內生成數百萬個皮升級微液滴的核心技術，可將伯樂原液滴數提升250-500倍。兩者的融合進一步穩固了伯樂在dPCR領域的領軍地位。

　　根據2019年財報，伯樂銷售額收入超23億美元，ddPCR增長強勁。2020年，Bio-Rad發布了全球首款數字PCR一體機：Bio-Rad的 QX ONE ddPCR系統，整合了微滴生成、熱循環反應及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作，提高了檢測通量。配備四個獨立的熒光通道，結合ddPCR特有的高階多重PCR技術，可以在單反應孔中實現8重拷貝數變異（CNV）檢測、5重突變檢測或4重基因表達檢測。兼容目前QX200 系統中所使用的supermix、assay和kit。

　　美國FDA近來批準了Bio-Rad實驗室開發的基于ddPCR技術的SARS-CoV-2檢測的緊急使用授權。

　　Thermo Fisher Scientific（賽默飛）

圖9 賽默飛QuantStudio? Absolute Q? dPCR 系統

　　2021年11月，賽默飛推出了基于微流體陣列式芯片技術的Applied Biosystems? QuantStudio? Absolute Q? dPCR 系統，該系統可在20480個固定納米級微孔中生成95%以上的有效反應液滴，具有更少的死體積，且ROX通道具有質控功能，非正常液滴予以排除分析；PCR擴增前后信號采集，自動排除假陽性。配備3個LED光源，最多支持5個熒光檢測通道，每份樣本中可同時進行多靶標檢測。

　　Roche（羅氏）

圖10 Digital LightCycler數字PCR系統

　　2021年11月，羅氏發布了基于Digital LightCycler System，在實驗流程上具備高自動化的硬件設計，擁有6色熒光檢測通道以及1通道的參比通道，針對通用檢測、高靈敏度及高分辨率三種不同的應用需求提供不同的納米孔板選擇，可將多至96個樣本的實驗速度提高至常規數字PCR的2倍。

　　此外，該系統可通過實驗室信息系統（LIS）對樣本進行信息自動化溯源，具有操作簡便、通量高、速度快、通道全等性能和優勢。

　　Fluidigm（富魯達）

圖11 BiomarkTM HD PCR系統

　　BiomarkTM HD作為一款高性能的PCR系統，利用微流控技術構建納升級反應體系，具有通量靈活、高度自動化的特點，整合了基因分型、基因表達譜、實時定量、數字PCR和單細胞基因表達譜分析等應用的多功能平臺。

　　基于高度集成的IFC微流控芯片，Biomark? HD系統在短短幾個小時內即可獲得近萬個數據點，具有顯著的成本和時間優勢。此外，該系統兼容多種不同規格的微流控芯片，在單一系統實現從中到高通量的實驗需求。Biomark? HD系統能給研究人員提供高通量和靈敏度低至單細胞水平研究的微流控芯片實時熒光定量PCR系統；該系統的優勢在于實時熒光定量和終點PCR兩種檢測模式最大化該平臺的靈活性；平臺開放，能與實驗時現行的Assay兼容，增加實驗靈活性；強大的、用戶友好的Biomark分析軟件使高通量SNP基因分型，基因表達定量和數字PCR數據分析更精簡實用。

　　Stilla Technologies

圖12 六通道數字PCR儀

　　成立于2013年的法國Stilla Technologies公司，早在2016年首次將三色目標多重檢測引入數字PCR。2020年又推出了六通道數字PCR儀，提升了Naica?數字PCR系統的多重檢測能力。Naica系統是一種高度靈敏的數字PCR解決方案，可在Crystal? 數字PCR系統上運行。它最初具有三通道檢測能力，如今具有六通道檢測能力，可鑒定多種類型的核酸，已成為精準醫療、伴隨診斷和疾病監控的理想工具。該系統簡單易用，可在不到三小時內快速生成結果。

　　QIAGEN（凱杰）

圖13 凱杰QIAcuity系列數字PCR系統

　　QIAcuity系列數字PCR集樣品分區、PCR擴增、信號檢測于一體。QIAGEN全新基于納米微孔板的一體化集成數字PCR系統，QIAcuity適用于對靶DNA或RNA分子進行絕對定量分析，兼容基于EvaGreen染料法或探針法的檢測。QIAcuity采用獨特技術，使實驗流程簡化至如同qPCR實驗一般簡單快速。QIAcuity基于納米微孔板技術，將數字PCR的樣本液滴制備、擴增和數據分析集成到全自動儀器中，在2小時內實現從樣本到數據解讀全過程。QIAcuity創新性納米微孔板采用微流體技術，配置好PCR反應體系后，儀器自動將樣品壓入微孔板的納米微孔中并對每個小孔獨立密封。納米微孔板技術可以做到物理分隔，保證分配到每個納米微孔中的液滴大小均一，無液滴破裂融合或交叉污染。

　　領航基因

圖14 全自動液滴數字PCR系統AD16

　　領航基因推出的全自動液滴數字PCR系統AD16，整合液滴生成、PCR擴增、多通道熒光檢測于一體，可自動實現樣本的微滴化處理，快速進行PCR擴增和檢測分析。AD16系統采用微流控芯片和油相表面活性劑，通過芯片上樣提取的核酸后，即可實現無人值守：完全實現從“芯片進，結果出”的全自動化流程。大大簡化了實驗操作步驟，縮短了實驗時間，全程僅約2小時。全自動液滴數字PCR系統提供對靶DNA或RNA分子進行絕對定量的一種方法，系統樣本制備儀和生物芯片閱讀儀實現與PCR擴增模塊無縫整合，使得數字PCR系統應用更廣泛。自動化系統減少了手工操作誤差、使樣本更穩定，后期檢測更準確，同時節約了時間和成本。領航基因已經有多項數字PCR相關產品獲得藥監局批文。

　　永諾生物

圖15 MicroDrop-20全新微滴式數字PCR

　　永諾生物-MicroDrop-20全新微滴式數字PCR采用全封閉防污染設計，一鍵式自動化操作。微滴生成采用油包水乳化微滴技術，在微管道中利用氣壓驅動，2mins生成數萬個微滴，高效高產。微滴生成芯片為高精度微流控芯片設計，三維微納防污染結構，一張芯片可同時處理8個樣本。微滴檢測使用雙通道熒光，支持EvaGreen染料法及探針法。檢測通量高，可一次檢測高達96個樣本，支持靈活設定。

　　臻準生物

圖16 AccuONE-200 數字PCR系統

　　AccuONE系統由上樣、擴增和分析三大功能模塊組成，核心技術涉及微納加工、精密儀器、生物試劑、圖像識別與算法等；不同規格芯片微孔數可達2萬、3萬或5萬，甚至更高；熒光通道數最多可達6個；系統操作簡單，自動化程度高。經過大量實驗表明，AccuONE系統的精確度和靈敏度等關鍵指標均已達到國外主流產品同等水平。上樣系統小巧精致，可實現自動化精確上樣，減少了人工操作。一鍵啟動，快捷簡便。通量的提高大幅提升了單日的檢測極限，在大樣本量的檢測需求下，用戶也可以從容應對。6色熒光通道配置實現了多重PCR檢測，節約了寶貴的實驗樣本。AccuApp軟件系統簡單直觀，界面潔簡友好，極大降低了用戶的上手難度。強大的AI算法加持，配合精確的圖像識別和數據統計，最終呈現給用戶清晰的圖像和準確的實驗數據。系統具有強大的兼容性和開放性，支持多種規格耗材，適配多種反應體系，開放的MIX試劑幫助客戶快速高效地開發自己的應用產品。

　　小海龜科技

圖17 BioDigital青/青Pro數字PCR系統

　　BioDigital青/青Pro數字PCR系統無需人工加樣，真正實現了全自動液滴制備。系統包括液滴制備儀 Loader S200、芯片擴增儀 Cycler S200和生物芯片閱讀儀 Imager S200，是完全自主知識產權的創新產品，單個樣本支持開機，可并行處理最高96個樣本，一次樣本用量26μL，有效液滴數2萬-20萬，具有更高的檢測范圍和超高的檢測靈敏度。系統標準設置4個熒光通道，可定制第5個熒光通道，在同類型數字PCR儀中處于領先地位。熒光通道數越多，單次反應可檢測基因位點越多。特別在靶向藥研究中，單次檢測位點數增多，使得臨床應用更靈活、廣泛。

　　BioDigital-青系列自動化程度高，可靈活組合，滿足多樣化及高通量需求。該系統可對熒光定量PCR或膠體金檢測卡檢測的灰區樣本進行精準的判讀。目前，小海龜科技已成功開發了40余種液體活檢相關的檢測試劑盒，BioDigital青系列數字PCR兼容第三方qPCR試劑盒，保證了試劑盒開發的高效性，預期未來3年內將在BioDigital系列數字PCR平臺上完成100余種應用試劑盒的開發。

　　新羿生物

圖18 新羿TD-2數字PCR平臺

　　近日，新羿生物5色微滴數字PCR生物芯片分析儀（TD-2）正式獲得醫療器械批文（京械注準20212220583），是全球首款基于流式檢測的5色微滴數字PCR分析儀獲得臨床準入。TD-2數字PCR的全封閉微滴PCR擴增和流式檢測系統，多重防污染設計，熒光檢測靈敏度高、信噪比好、多指標檢測能力強、液滴數目不易受限制。

　　TD-2數字PCR利用激光準共聚焦光路高效激發液滴熒光，在光譜帶寬內完成更多熒光通道檢測，ZL算法消除通道間的熒光串擾，實現5色熒光通道同步高速檢測。