文獻中遇到的實驗動物知識：基因敲除小鼠

我在這里想寫一些看文獻時可能遇到的實驗動物知識，希望對大家有幫助。為了便于理解，語言偏通俗，可能不夠嚴謹。如果大家希望深入了解實驗動物專業知識，歡迎選修實驗動物學。

第一集，關于基因敲除小鼠。

基因敲除小鼠（Knockout Mice），人們使用復雜的方法使小鼠體內的某一個基因不表達，從而使小鼠呈現這個基因缺失的狀態，可用于研究這個基因的功能。

但如果某個基因功能特別重要，這個基因缺失可能具有胚胎致死性，那我們就無法得到這種基因敲除的小鼠了，于是人們發明了條件性基因敲除技術。這一技術可以實現在特定的時間、特定的細胞或組織內使某個基因沉默。方法是首先在目的基因（就是打算敲除的那個基因）的兩側分別插入一段名為LoxP的DNA序列（LoxP序列是一段34bp的DNA序列，兩端的13個堿基為回文序列，中間的8個堿基決定LoxP的方向。具體序列如下：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'

3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'）。然后我們需要用到一種帶有Cre酶的轉基因小鼠了。

下面分別解釋一下轉基因小鼠和Cre酶。

轉基因小鼠（Transgenic Mice），使用分子生物學方法使小鼠表達了一種小鼠本來沒有的基因，這個基因是人為插入的，可能是人的，大鼠的或者其他物種的。這個星球上第一只轉基因小鼠就表達了大鼠的生長素（growth hormone）基因，于是那只小鼠長到了大鼠的體型。

Cre酶是在噬菌體內發現的一種酶，它能特異性的識別LoxP序列，并把同方向排列的兩個LoxP序列之間的DNA切掉。前面說了，我們把LoxP序列放到了打算敲除基因的兩側，那么我們如果把Cre酶放到細胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，從而實現目的基因敲除了。于是人們制作了能夠表達Cre酶的轉基因小鼠。把Cre轉基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同時攜帶Cre和LoxP序列的小鼠了。當Cre在細胞核內遇見LoxP序列，目的基因就被敲除了。

想控制在哪個細胞或者什么時間敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。制作Cre轉基因小鼠時在Cre酶前面放上特異性的啟動子，那么Cre酶就在該啟動子表達的細胞或組織內表達，這樣就只有這個組織或細胞內的目的基因被敲除。

時間上控制基因敲除的方法更為巧妙。人們修飾了Cre酶基因，修飾后的Cre基因可以轉錄為mRNA，也可以在核糖體上翻譯為蛋白質。但是這種蛋白沒有穿過細胞核膜的能力，也就無法進入細胞核發揮切割DNA序列的功能。當人們外源性給予藥物他莫昔芬（tamoxifen，縮寫TM，是雌激素類似物）后，修飾的Cre酶就會獲得穿過細胞核膜的能力。于是Cre進入細胞核，與基因組相遇，切割掉LoxP之間的序列。于是人們實現了什么時候給藥，什么時間敲除基因（當然得給Cre一點時間穿過細胞核膜）。需要注意的是，Cre是一種酶，那么和所有酶一樣，它的作用效果不會是百分之百的。也許100個細胞里表達了Cre，大約70個細胞內的基因被敲除。

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Knockin mice，基因敲入小鼠。制作轉基因小鼠時，外源基因是隨機插入基因組的，具體插入哪個位置不一定。基因敲入技術可以實現把外源基因準確的插入到指定位置，其原理、方法都和Knock out一樣，不過這里我們不講原理。最開始，人們使用Knockin技術是為了制備Cre小鼠，Cre被插入到ROSA26基因后面，因為ROSA26是一個在所有細胞都表達的一個基因。Cre放在這個基因后面，可以得到全身表達Cre酶的小鼠。后來Knockin技術被更多方式的應用，比如把綠色熒光蛋白（GFP）基因放在目的基因末尾，使目的基因與GFP融合表達，那么使用熒光顯微鏡觀察表達綠色熒光的細胞即為表達目的基因的細胞，巧妙的發現該基因的表達位置。