斑馬魚的基因敲除定制（Cas9KO）法介紹

利用 CRISPR/Cas9 技術，針對靶基因序列設計 sgRNA， 指導 Cas9 蛋白在特定基因位點引起 DNA 雙鏈斷裂，在非同源性末端接合修復斷裂 DNA 的過程中，靶基因堿基突變或缺失被引入到斑馬魚基因組中，最終導致靶基因無法正常轉錄翻譯，達到基因敲除的目的。目前我們利用 CRISPR/Cas9 技術，提供 TU 品系的基因敲除斑馬魚制備，TU 系是最為普遍使用的標準純遺傳背景品系之一。同時也可根據委托方的需求，提供 AB 以及其它遺傳背景的基因敲除斑馬魚服務。 

• 班馬魚基因靶向改造敲除突變體的建立技術路線

• 分析目標基因的基因組結構，確定目標基因靶向位置

• 通過Sanger測序，確認目標基因靶向位置序列信息準確

• 根據每個目標基因的靶向突變位置，設計并體外合成4條不同的sgRNA

• 制備Cas9 mRNA或蛋白質

• 鑒定所制備的4條sgRNA是否具有在斑馬魚胚胎內引導Cas9切割目標基因的活性

• 將有活性的sgRNA和Cas9 mRNA（或蛋白質）共同注射斑馬魚受精卵

• 待注射胚胎生長至6 hpf后，隨機選取5枚胚胎，確認Founder胚胎細胞攜帶目標基因突變的等位基因

• 將經注射的受精卵飼養至45-60日齡時，通過對尾鰭的基因組鑒定確認Founder（F0）體細胞攜帶目標基因突變的等位基因

• 獲得F0的后代F1代

• 至45-60日齡時，通過剪尾鰭的方法進行基因型鑒定，篩選F1個體，獲得基因敲除突變體

• 乙方為甲方提供的最終服務產品

• 提供可有效識別  基因的靶向突變位置基因組序列的sgRNA不少于1條

• 提供攜帶   基因靶向突變的雜合子（當純合突變不致死時，可能是兩個等位因均突變的純合突變子）斑馬魚（不小于1月齡） 3 尾（基因型可不相同）。

2.3上述突變體中，目標基因的突變應在外顯子所在區域，位于起始密碼子后，其突變類型為插入或缺失（Indel）突變，且應是移碼突變，導致目標基因編碼序列出現提前的終止密
碼子,預期編碼一個截短蛋白；或者，突變的位置由客戶指定，經乙方認定可行后，實施靶向改造，造成插入或缺失（Indel）突變。
2.4提供上述突變的目標基因等位基因的基因型（附有測序報告）；
2.5提供鑒定上述突變體的鑒定方法；

• 提供階段性項目進展報告

• 提供上述基因靶向突變的斑馬魚突變體建立過程的技術服務項目總結報告。