新一代測序十年記：后起之秀PacBio

　　在新一代測序技術崛起的早期，市場主要被Illumina、Life Tech和Roche這三家公司占領。偶爾也有一些新的測序平臺出現，但大多是雷聲大雨點小，不久便沒了下文。面對這些強大、成熟的系統，新平臺要想站穩腳跟，的確不是件容易的事。

　　在2010年的AGBT年會上，Pacific Biosciences的測序儀吸引了眾人的注意。這臺名為PacBio RS的測序儀被稱為第三代測序平臺，而有別于之前推出的二代測序平臺。至于什么是第三代測序，PacBio當時的CEO Hugh Martin是這樣解釋的，“它就是在第二代測序（通量、成本）的基礎上添加非常長的讀長、極低的試劑成本，以及快速的運行時間”。

　　的確，PacBio RS系統有著其他系統無可比擬的讀長，超過1000個堿基。這是因為PacBio的單分子實時（SMRT）測序反應是最接近天然狀態的聚合酶反應體系，最大限度地保持了聚合酶的活性。此外，樣品制備非常快速，只需要4-6小時，而不是幾天。制備過程不需要PCR，從而減少了錯誤和偏向。從樣本制備到測序，所需的時間還不到一天。

　　對于重測序而言，短讀長也許不是大問題，但是對于de novo測序，這可讓人們吃盡苦頭。例如，韓國極地研究所的Hyun Park在測序一種GC含量高達71%的極地微生物時發現，即使利用Illumina平臺進行200X深度測序，仍無法獲得完整的基因組圖。組裝時產生了185 個Contig，而且缺口數量太多，根本無法通過Sanger法有效補齊。他們只好求助于PacBio，而后僅用15X覆蓋度就能組裝得到26個Contig，最終獲得了完整的基因組信息。

　　隨后，《Nature Methods》上發表的一篇文章又再次讓PacBio成為關注的焦點。研究人員利用SMRT技術，直接測定了DNA的甲基化，這是二代測序技術無法實現的，因為它們在測序前需要PCR擴增，一擴增這些修飾標記就被置換而消失殆盡了。SMRT技術利用DNA聚合酶的動力學特征，對堿基摻入時產生的停頓間隔脈沖信號足夠敏感，可區分12種以上不同類型的堿基修飾。這些信息也幫助解析了歐洲大腸桿菌疫情的元兇E. coli O104:H4。

　　然而，PacBio也受到高錯誤率的困擾。人們一聽到85-87%的原始準確性就嚇壞了。雖然PacBio也澄清，這是由于在測序過程中單個分子信號弱，偶爾會出現信號難于分辨的情況。出錯幾率是隨機的，與序列長度、序列組成無關。只要提高循環次數，就能夠提高準確率。不過，PacBio的業務還是一度陷入低迷，股價在1塊多徘徊。

　　2012年，事情開始出現轉機。冷泉港實驗室的Michael Schatz開發了一種糾錯算法，用二代測序的短讀長高精確數據對三代長讀長數據進行糾錯，這種稱為“混合糾錯拼接”的算法發表在7月的《Nature Biotechnology》上。通過混合糾錯法，他們發現“數據幾近完美”。

　　這種方法融合了二代測序和三代測序的優勢。“對于短讀長，哪怕無限制地提高覆蓋度，也不能解決復雜區域的測序問題。但長讀長可以跨越這次復雜區域，因此不需要太高的覆蓋度就可以對付。同理，長讀長也可以用于檢測并鑒定單倍體型和轉錄本的可變剪切，”Schatz談道。

　　第二年，PacBio發布了新版本的測序儀 C PacBio RS II，平均讀長達5,000 bp，最長讀長超過20,000 bp，且通量較之前的版本增加一倍。隨著硬件和軟件的不斷升級，訂單數量也開始增加。到2013年底，PacBio更與Roche合作，聯手打造一款臨床測序產品。此后，引用PacBio系統的研究成果不斷在各種刊物上發表。

　　Illumina超高通量測序平臺HiSeq X Ten的上市也為PacBio帶來了新訂單。韓國公司Macrogen和J. Craig Venter的Human Longevity在安裝了HiSeq X Ten系統之后都購買了兩臺PacBio RS II系統。他們在開展大規模人類基因組測序研究時，希望利用PacBio的長讀長來弄清結構變異及其他復雜區域。

　　至此，PacBio完成了一次漂亮的逆襲。它憑借自身的獨特優勢，在競爭激烈的新一代測序市場上站穩腳跟，并帶來豐碩的研究成果。當然，儀器仍在不斷升級。最新型號的Sequel測序儀將在明年上市。