新型全轉錄組單堿基分辨率N6甲基腺苷（m6A）檢測方法

　　在已知的100多種RNA化學修飾中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核細胞mRNA中最豐富的形式之一，占所有腺苷的0.1%~0.4%。m6A修飾可影響mRNA代謝的不同階段以及長非編碼RNA和microRNA產生，是RNA和表觀修飾領域的重要研究方向。已有研究表明，m6A能夠影響多種生物學過程，包括神經元發育、細胞命運轉變、免疫反應、DNA損傷反應和腫瘤發生等。因此精準定檢測m6A對了解其與人類發育和常見疾病的廣泛聯系有著重要意義。

　　由于m6A的化學性質與腺苷類似，所以難以通過化學反應進行鑒別。為準確鑒定m6A，科學家開發了多種檢測方法。甲基化RNA免疫共沉淀測序(merip-seq或m6A-seq)已被廣泛用于m6A分析，但其精確度較低。雖然也有很多檢測方法在分辨率方面進行了改進，例如PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP，但這些方法都依賴于m6A特異性抗體。由于抗體存在親和力變化和批次效應等問題，難以準確量化甲基化水平。此外，以上檢測方法的重復性差、樣品需求量大、檢測過程比較復雜。因此，開發一種簡便的單堿基分辨率方法進行全轉錄組m6A的鑒定和定量，有助于提高人們對m6A生物功能的理解。

　　近日，中山大學駱觀正教授聯合美國芝加哥大學何川教授領導的研究團隊開發了一種新的高通量m6A鑒定方法（m6A-sensitive RNA-Endoribonuclease-Facilitated sequencing，m6A-REF-seq），該方法基于新發現的RNA內切酶MazF對m6A的敏感性，能夠以單堿基分辨率量化甲基化水平，對全轉錄組范圍的m6A進行精準檢測，且不依賴于抗體，克服了傳統m6A鑒定方法的局限性。7月3日，相關研究成果發表在Science Advances上，文章題為“Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method”。

　　為開發高效的鑒定方法，研究團隊通過篩選內切核糖核酸酶庫，發現了2種能夠區分m6A和未甲基化腺苷的酶：MazF和ChpBK。經過裂解分析，MazF具有更高量化甲基化水平的潛力。在篩選出對m6A敏感的MazF酶后，研究團隊利用其開發的m6A-REF-seq可以識別特定序列的轉錄組m6A位點，并能以單堿基分辨率量化甲基化水平，如圖1。

圖1. 基于m6A敏感性RNA內切核糖核酸酶的m6A鑒定方法。（A）驗證MazF的甲基化敏感性。（B）驗證ChpBK的甲基化敏感性。（C）含有m6A的寡核苷酸與內切核糖核酸酶消化的未甲基化寡核苷酸混合的各種比例。（D）內切核糖核酸酶消化的按比例混合的RNA寡聚物的相對灰度。（E）m6A-REF-seq檢測的示意圖。

　　為了降低假陽性，確保m6A-REF-seq鑒定m6A位點的可靠性，研究人員使用m6A去甲基化酶FTO在體外處理mRNA作為對照，只有在FTO處理組中甲基化比例降低的位點才被認為是準確的m6A位點。同時，研究人員也使用RNA二級結構預測軟件對備選m6A位點附近的二級結構進行預測，并去掉受二級結構影響的位點。

圖2. m6A-REF-seq數據分析流程

　　利用m6A-REF-seq技術，研究人員對HEK293T細胞系的m6A修飾進行了鑒定。研究發現，該方法具有高靈敏度和特異性。研究人員共獲得4260個高置信度的m6A位點，這些位點的分布與MeRIP-seq測序結果非常相似。此外，m6A-REF-seq生成的全轉錄組單堿基分辨率m6A圖譜可以定量的顯示終止密碼子附近富集的線性分布模式，且發現其主要存在于經典的DRACA或RRACA motif中。

圖3. 其他m6A鑒定方法驗證m6A-REF-seq的準確性與可靠性

　　為驗證m6A-REF-seq的準確性和可靠性，研究團隊利用獨立方法驗證了單個m6A位點的甲基化狀態和豐度，如圖3。不同方法檢測結果的高度一致性證明m6A-REF-seq具有高效率和高度可靠性、準確性。利用qPCR，研究人員證實m6A-REF-seq方法可以量化特定m6A位點的甲基化水平，如圖4。此外，研究人員將m6A-REF-seq應用于人、小鼠和大鼠的五種組織，發現m6A位點具有單核苷酸特異性，且傾向于在物種間聚類。

圖4. 利用qPCR驗證m6A-REF-seq量化特定m6A位點甲基化水平的能力

　　在轉錄組水平上全面解析m6A是揭示這種mRNA修飾生物學意義的關鍵。駱觀正教授以及何川教授領導開發的m6A-REF-seq技術具有更高的靈敏度和更低的假陽性率，并且擺脫了傳統鑒定方法對抗體的依賴性，同時大大降低了樣本起始量，使得某些稀缺樣品也能進行m6A研究。高效便捷的m6A-REF-seq技術為轉錄組單堿基水平的m6A鑒定提供了新的方法和視角，有助于大幅提高m6A研究的范圍。

　　參考資料：

　　Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method

　　https://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaax0250