新型DNA結構的熒光張力探針于活細胞機械力可視化研究

　　電學、化學和力學是細胞內最常見的三大信號系統，它們相互協調，共同維持著細胞的生命活動。前兩者已被人們廣泛研究,而細胞的機械力信號傳遞過程因缺少有效的研究方法，人們一直對其認識有限。研究表明，細胞在體內擁擠的環境中不僅通過擠來擠去以獲得足夠的生存空間，同時，細胞的生命過程也不斷的受到擠壓、拉伸、彎曲和拉扯細胞外基質（ECM）等過程產生的機械力調控。盡管細胞上每個受體上傳遞的機械力小得令人難以置信——分布在幾pN到幾十pN的范圍，但是這些機械力信號可以深刻影響著胚胎發育、腫瘤遷移、免疫識別等多種過程。因此，在空間和時間上對細胞機械力進行精準地表征，將可以幫助我們深入認識細胞如何利用微觀力學信號誘導和改變相關的生物化學信號。近十年來，基于分子力學傳感器的力學可視化技術的提出，使得我們可以在分子水平上窺探細胞機械力傳遞過程和機制。但是，目前報道的多種分子力學傳感器難以兼顧測量范圍和可逆測量的需求，這限制了我們對細胞機械力信號傳導的研究。

　　2021年5月31號，來自武漢大學高等研究院的劉鄭課題組在Nature Cell Biology雜志上發表了題為 A Reversible shearing DNA probe for visualizing mechanically strong receptors in living cells 的研究論文。文中介紹了一種基于DNA結構的新型分子熒光張力探針并應于活細胞的力學可視化的研究，該探針集成了目前已發展的DNA力學傳感器的多種優點，可以可逆的對細胞膜上單個蛋白上傳遞的4-60 pN范圍的機械力進行長時間成像，是此前可逆傳感器測量范圍的3倍 (該范圍幾乎覆蓋了大多數力學信號傳導過程) ，并且該分子結構還可以進一步改造成光控力學探針，通過光控切割來改變DNA力學探針的機械結構，使其瞬間從可逆狀態轉成不可逆狀態，進而可以用于限制細胞力學的大小，研究特定機械信號通路的生物學功能。利用這一類力學探針，研究人員展示了可以在不擾亂粘附生物學的情況下，輕松地分辨出蛋白受體在力學傳遞過程中的物理差異，并對這些力學信號進行長時間可視化實時追蹤。觀察到了細胞遷移過程中存在一類少量、但傳遞著更強力學信號的整合素受體蛋白團簇（稱為“力學熱點”），進一步揭示了這些“力學熱點”調控了細胞黏附行為、黏著斑的生長過程以及細胞遷移等重要的細胞生物學過程。

　　首先，作者提出了一種可逆的剪切模式DNA發卡結構的力學探針，其雙鏈的耐受力闕值可以通過改變發卡的力學結構而進行大范圍的調節，打開該DNA結構所需的機械力由受力的位置和DNA發卡的自由能共同決定。為了合成出該探針，作者設計了一套該DNA探針的化學修飾、合成以及純化策略。當DNA發夾處于折疊狀態時，其探針的熒光團被淬滅劑（BHQ）和Au NP通過熒光共振能量轉移（FRET）和納米表面能量轉移（NSET）兩種途徑高度淬滅，從而提高了張力探針的力學敏感性。一旦細胞通過探針上的配體對ECM施加機械力，并達到該探針的展開闕值力，DNA探針結構展開分離熒光分子和淬滅劑，隨即點亮該探針。通過該過程，可將單個蛋白質上傳遞的微觀機械力信號轉化成熒光信號進行觀測。由于發卡機構中loop結構的存在，當牽引力減小到一定程度時，DNA發卡結構會自然關閉，進而可以對細胞的機械力進行實時成像。

　　圖1. 可逆的剪切模式DNA發卡結構的力學探針原理及用于細胞力學可視化研究。

　　基于該力學探針對胚胎成纖維細胞在鋪展和遷移過程中整合素 (Integrin) 介導的不同大小的機械力進行長時間成像，研究人員發現細胞的黏著斑結構中，integrin力的分布明顯是不均勻的，黏著斑中間的少量的integrin組成的團簇承受了一個巨大強度的機械力（>60 pN, 該integrin團簇稱為“力學熱點”），并發現這些“力學熱點”類似于高樓大廈的承重墻，對促進黏著斑的成熟以及維持整個結構的穩定具有很重要的作用。研究結果表明，對于新生的黏著斑，integrin分子所承受力的大小直接影響這些新生黏著斑能否成長為更成熟、更穩定的結構。如果沒有承受較大力的整合素（稱為 “strong” integrin）存在，黏著斑的壽命明顯偏低。為了深入探索這些“strong” integrin功能，作者進一步設計了一種可以光控切割的DNA力學探針，并在成熟的黏著斑結構中，用光選擇性地瞬間切斷黏著斑中極其稀少的“strong” integrin與ECM的銜接，發現黏著斑結構會迅速解聚，單分子力學成像實驗進一步證實這些“strong” integrin可以在單分子水平上調控FA結構的組裝和壽命，進而影響著細胞遷移。此外，作者利用該探針具有極高靈敏度優勢，研究了胞內actin 自組裝聚合時所產生的微弱力學信號特征，并利用單分子成像和熒光漂白計數等方法對單個integrin團簇中受力蛋白進行了量化和功能研究。

　　圖2: 光控分子力學探針原理以及應用于特定力學受體功能的研究。

　　綜上所述，該工作設計出一種新型DNA結構的熒光張力探針并應用于活細胞機械力可視化研究，具有力學量程寬、可逆、單分子靈敏度等優勢，并可以用光來控制該探針的機械結構進而達到控制細胞力的功能。通過對細胞遷移過程中integrin介導的機械力進行研究，發現了一類少量、但傳遞更強機械力的integrin在細胞運動過程扮演著重要角色。該技術有望成為研究腫瘤細胞遷移、免疫細胞的識別和激活等機械力深度參與的生命過程的重要工具。

　　武漢大學高等研究院博士生李洪云為第一作者，劉鄭教授為該論文的通訊作者。合作者包括武漢大學生命科學學院張興華研究員以及博士生張晨同學（負責探針的標定），以及中山大學物理系馬杰教授。

　　劉鄭教授課題組目前主要從事開發多種功能的分子—細胞力學研究技術，并利用這些技術深入研究機械力在腫瘤遷移、免疫細胞識別和激活以等過程中扮演的角色和分子機制。課題組主頁：www.liulabwhu.org, 歡迎對生命交叉課題感興趣的同學加入！