無菌感染期線蟲的誘導培養

實驗概要

掌握無菌 S. carpocapsae A24品系感染期線蟲的誘導培養。

主要試劑

1. 瓊脂糖（Agarose），進口分裝，上海Yito公司；

2. 胰蛋白胨（bacto-tryptone）、酵母浸出粉（bacto-yeast extract），英國OXOID公司；

3. 瓊脂粉，廣東環凱微生物科技公司；

4. DEPC，Bio Basic inc公司；

5. LB培養基

Tryptone                     10 g

Yeast Extract               5 g

NaCl                           10 g

pH                              7.2

加水至1000 mL（固體培養基加1.8％瓊脂粉）；

6. 80％甘油：稱取100.8 g甘油（密度為1.26 g/cc）于20 mL 雙蒸水中，高壓滅菌15 min，室溫保存。

主要設備

1. MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋電機株式會社；

2. CF43S超凈工作臺，Gelman公司；

3. 高速冷凍臺式離心機，Heraeus Sepatech公司；

4. THZ-C恒溫振蕩器，廣州市深華生物技術公司；

5. BL150S型電子天平，德國Sartorius公司；

6. GB 1302型天平，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司；

7. C-90-1型電熱恒溫水浴鍋，廣州市越秀區醫療器械廠；

8. 微波爐，日本Sharp；

9. YXQ.WY21-600IIR臥式高壓蒸汽消毒器，廣州市醫療設備廠；

10. XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠。

實驗材料

1. 小卷蛾斯氏線蟲 S. carpocapsae A24品系；

2. 共生細菌X. poinarii RS92品系。

實驗步驟

1. 單菌線蟲S. carpocapsaeA24的培養

參照Han et al.（1990）^[1]和韓日疇（1995）^[2]建立的方法，將無菌S. carpocapsae的A24品系與X. poinarii的RS92 共生細菌菌株建立單菌組合（RS A）并用人工培養基進行體外培養^[3,4]。人工培養基成分為1％蛋白胨，1％牛肉浸膏，20%雞蛋，15％豆粉，5%豬油，8%聚乙醚氨基甲酸酯海綿和50%無離子水^[93]。培養溫度25℃。

2. 無菌感染期線蟲S. carpocapsae A24的獲得

上述線蟲培養30天后，進行體表消毒，即可獲得無菌感染期線蟲。具體方法如下：

   1)     將培養好的RS A組合的線蟲培養基倒入已消毒的帶濾布及篩網的不銹鋼盆內，加無菌水室溫浸泡約3 h，浸泡時以不銹鋼盆蓋住，以防止飛蟲的污染。大部分感染期線蟲將從海綿培養基中爬出，穿過濾布沉淀于容器底部；

   2)     移去濾布、篩網和網內的海綿及培養基等雜質，靜沉后，傾去上層液, 加入無菌水清洗線蟲6～7次，每次約15 min；

   3)     將線蟲液轉入三角瓶中，以0.5%硫酸鏈霉素室溫，100 rpm，振蕩消毒6h，以保證抗菌素充分接觸線蟲；

   4)     用無菌水清洗線蟲6～7次，再用無菌樂百氏水清洗線蟲至少2次，每次約15 min；

   5)     最后得到無菌的感染期線蟲懸液100 mL～200 mL，稀釋到一定濃度，分裝若干瓶；

   6)     取樣計數，計算出每毫升懸液中的線蟲含量，于4℃搖床中保存；

   7)     取200 μL線蟲懸液滴入100 mL LB培養基中，100 rpm振蕩，檢測帶菌情況。取少量線蟲液滴到LB平板上，檢測帶菌情況。

3. 無菌感染期線蟲A24的誘導

   1)     取-80℃共生細菌 X. nematophila A24 甘油儲存菌20 μL于200 mL在LB平板上劃線，25℃，培養48 h；

   2)     從LB平板上挑取單菌落接種至4 mL LB液體培養基中，25℃，200 rpm，振蕩培養36 h。將活化菌按3％接種量轉接至200 mL培養基中，振蕩培養36 h；

   3)     將菌培養液置于15 mL無菌的離心管中，4℃下，6000 rpm 離心15 min；

   4)     取上清，細菌過濾器除菌到無菌燒杯中，混勻；

   5)     于6＃細胞培養板中，分別加入3 mL菌過濾液，再加入100 μL無菌感染期線蟲，25℃約100 rpm下誘導恢復10 h；

   6)     同樣的操作，用Ringer’s 溶液作對照；

   7)     將處理的線蟲吸到經DEPC水處理過的無菌離心管中，離心（25℃，2000 rpm，1 min），吸棄上清；

   8)     加適量的0.2%DEPC水清洗線蟲，離心（25℃，2000 rpm，1 min），重復清洗4次；

   9)     將清洗最后一次的線蟲轉入已稱量的無菌離心管內，再稱量算得線蟲的體積，將離心管放入燒杯，加液氮，-80℃貯存。

參考文獻：

1. Han R C, Wouts W M, Li L Y. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristic of possible Xenorhabdus luminescens subspecies[J]. Rev. Nematol. 1990, 13: 411~415.

2. 韓日疇. 昆蟲病原線蟲大量培養系統的優化管理（D）. 華南農業大學博士研究生畢業論文，1995.

3. Bedding R A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species （Nematoda） for field control of insect pests[J]. Nematologica.1981, 27: 109~144.

4. Wouts W M. Mass production of entomogenous nematode Heterorhabditis heliothidis（Nematoda：Heterorhabditidae） on artificial media[J]. Journal of Nematology.1981, 13: 467~469.