最先進的基因編輯工具CRISPRCas成CNS大熱門

　　今年1月，世界上有四個科研團隊都對一種基因編輯工具——CRISPR-Cas系統進行了報告。越來越多的科學家開始對CRISPR-Cas系統進行研究。許多科研團隊利用它來刪除、添加、激活或抑制人體、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞中的目標基因，從而證明了這個技術的廣泛適用性。就在上個月，中國科研人員就CRISPR-Cas展開研究，在Nature子刊上連發三篇文章。如今，CRISPR-Cas系統已經逐漸成為科學家們的新寵。

　　CRISPR-Cas工作原理

　　CRISPR指的是規律成簇的間隔短回文重復(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。CRISPR/Cas是在大多數細菌和古細菌中發現的一種天然免疫系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。Sigma CRISPRs利用可定制的RNA-核酸酶復合物來實現哺乳動物基因組特定位點的編輯。

　　在細菌中，來自入侵病毒的短DNA序列(間隔區)被摻入CRISPR位點，充當之前感染的“記憶”。再次感染引發互補的成熟CRISPR RNA(crRNA)找到匹配的序列，為CRISPR相關(Cas)核酸酶在特定DNA序列切割雙鏈提供了特異性。

　　Cas9 是由crRNA和tracrRNA(反式激活crRNA)引導、切割特定DNA序列的核酸酶。引導RNA(gRNA)可設計成包含發夾結構，以模擬 tracrRNA-crRNA復合物。結合特異性是根據gRNA和三核苷酸NGG序列(protospacer adjacent motif，PAM)。對于位點特異的編輯，CRISPR/Cas9系統至少需要Cas9核酸酶和gRNA。

　　消除脫靶效應

　　今年6月,美國麻省總醫院的科學家J. Keith Joung博士發現CRISPR-Cas RGN也存在重大的局限性，它會在基因組的非目標位置產生非必要的DNA突變，也就是脫靶效應(off-target effect)。

　　為了減弱甚至消除脫靶效應，科學家提出了不同的方案。

　　美國麻省理工學院的張峰教授的研究團隊認為有兩種方式可以提高序列靶向特異性。第一種就是利用計算機模型。第二種方法就是調整導向RNA序列的量。在一般情況下，減小RNA序列的量可以減弱脫靶效應，但是不利于目的基因的裂解。對于每一個序列來說，高目標效應和低脫靶效應間存在一個最優的平衡點，這是可以計算出來的。

　　哈佛醫學院的George Church研究小組生成了一系列的Cas9突變體，這些Cas9突變體沒有生成雙鏈斷裂，而是引入了偏移缺口，每個缺口只影響一條DNA鏈。盡管這一策略實質上造成了雙鏈斷裂，它通常不會導致非同源末端連接(雙鏈斷裂的一種細胞修復機制)引起的插入或刪除。因此，這種方法可能會減少脫靶效應。

　　引發科研狂潮

　　如今，被NCBI(美國國立生物技術信息中心)收錄的關于CRISPR-Cas的文章已有201篇。就在上個月，中國科研人員就CRISPR-Cas展開研究，在Nature子刊上連發三篇文章。

　　中國科學院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞教授發表的文章是闡述利用CRISPR-Cas修改農作物的基因組。利用CRISPR，她的團隊成功地令大米的4 種基因失去功能，這意味著該技術可以用于改良大米這種重要的農作物。至于小麥，科研人員剔除了一種基因，使小麥獲得了白粉病抗性。

　　上海市調控生物學重點實驗室、華東師范大學生科院生命醫學研究所劉明耀教授和李大力副教授課題組則將該技術運用到基因敲除小鼠和大鼠動物模型的構建之中。研究發現：RNA注射的方式將CRISPR-Cas系統導入小鼠受精卵比DNA注射能更有效的在胚胎中產生定點突變;該方法無小鼠遺傳品系的限制，能夠對大片段的基因組DNA進行刪除;同時注射針對不同基因的RNA序列能夠在同一只小鼠或大鼠中產生多個基因突變。此外，課題組利用CRISPR-Cas技術構建的基因敲除大鼠模型與傳統方法構建的同一基因(肥胖相關G蛋白偶聯受體Mc4R)突變大鼠具有一致的表型。而中國科學院動物研究所的周琦博士發表的文章也是關于運用CRISPR-Cas技術到大鼠模型的構建的。

　　成本低廉

　　CRISPR的使用成本很低：免費的軟件使得設計向導RNA(用于針對特定的基因)的成本為零，另外只需花費65美元便可以從名為Addgene的基因資源庫中獲取基因，來設計自己的CRISPR系統。自今年開始，Addgene(共有11個科研小組為它提供了可用于CRISPR系統的DNA序列)已經見證了5000種 CRISPR構造的產生。今年7月，Addgene在一周內就收到了(為了設計一種新構造的)100份訂單，Addgene的執行董事Joanne Kamens說：“Addgene正在熱賣中。”

　　8月底，Sigma-Aldrich公司也宣布推出Sigma CRISPRs，一款經濟的哺乳動物基因組編輯工具，適合篩選和探索性研究。這是繼鋅指核酸酶(ZFN)以來，Sigma推出的第二款基因組編輯工具。

　　Sigma CRISPRs以單個質粒載體提供，其中包含GFP，可快速富集編輯過的細胞。當然，您也可以利用專門的生物信息學工具在線定制。

　　Sigma獨有的在線設計工具讓用戶可根據CRISPR/Cas靶定的要求，識別人、小鼠和大鼠外顯子中的最佳靶位點。它能夠自動應用CRISPR/Cas最佳設計實踐，包括靶位點與基因組中其他位點至少要求3個堿基對不匹配，從而最大限度減少了脫靶效應。

　　“Sigma 在2008年開發出CompoZr ZFN技術，如今ZFN已成為基因組編輯的金標準。我們利用這一專長創造出Sigma CRISPRs，它讓研究人員以更快、更經濟的方式篩選目的基因。在利用Sigma CRISPRs 鑒定出重要靶點之后，可通過超特異的CompoZr ZFNs 來驗證生物學上相關的突變，以減少潛在的脫靶，”Sigma Life Science功能基因組學市場部經理Shawn Shafer博士談道。

　　Sigma-Aldrich研發部門的首席研究員Greg Davis博士認為：“操控哺乳動物基因組的能力對生物學而言是革命性的。Sigma CRISPR/Cas技術作為一款早期、經濟的基因編輯工具，為開發和使用帶來巨大希望。”