實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
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| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 3.1 提取總蛋白質 （見注釋 5) ( 1 ) 將去塞的 10 ml 空離心管稱重。我們選用韌性好的聚碳酸酯旋蓋圓底高速離心管。 ( 2 ) 細胞碎裂：500 mg 新鮮組織（保存在 -80°C ) 在液氮中用研缽和杵搗成粉末狀。 ( 3 ) 用 8 ml 預冷沉淀緩沖液將粉末再次溶解。 ( 4 ) 將混合物轉移到稱重過的離心管中。 ( 5 ) 用 2 ml 預冷沉淀緩沖液漂洗研缽。 ( 6 ) 將漂洗液也轉移到離心管中。 ( 7 ) 輕輕上下翻轉離心管 15s 混合，然后讓蛋白質在 -20°C 沉淀 1h。 ( 8 ) 在 16000 g 離心 15 min ( 見注釋 6)。 ( 9 ) 輕輕倒出離心管里的上清液。 (10) 用 10 ml 預冷漂洗緩沖液漂洗離心管中的沉淀（除掉殘留的 TCA ) ，并讓離心管在 -20°C 反應 1h。 (11) 在 16000 g 離心 10 min ( 見注釋 6) 。 (12) 真空干燥沉淀 2 h。 (13) 用玻璃棒將沉淀打碎成粉末狀。 (14) 連同干燥的沉淀一起稱重離心管。 3.2 溶解蛋白質 ( 1 ) 用溶解緩沖液將粉末重懸。每毫克粉末用 10~30 μl 緩沖液溶解。這種緩沖液含有混合的離液劑（尿素、硫 脲）、去垢劑 （Triton-X 100，CHAPS ) 、還原劑 ( DTT) 、載體兩性電解質（IPG 緩沖液)。 ( 2 ) 在室溫，400 g 離心 4 min，去除不溶性物質（如細胞碎片）。 ( 3 ) 將上清液倒入一支干凈的離心管。 ( 4 ) 在室溫，400 g 離心 4 min，將上清液倒入一支干凈的離心管。 ( 5 ) 在 -80°C 保存上清液。 ( 6 ) 根據 Ramagli 等 [8] 描述的方法，濃縮蛋白質可以用超過 6 次的重復定量實驗。計算出平均濃度，每根 IPG 膠條上樣 300 μg 蛋白質。 |
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