先天性肺部疾病，例如表面活性蛋白缺乏癥、囊性纖維化、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥等等，會導致終身發病甚至是死亡。雖然這些疾病的遺傳機制已經被深入研究，但仍然缺乏有效的治療方案。最近，可吸入式mRNA遞送平臺備受制藥業和學術界的關注。這種平臺可以提供非侵入性、直接進入肺上皮細胞和肺泡的RNA藥物，在應用于囊性纖維化、特發性肺纖維化、肺癌和肺部感染等多種肺部疾病治療方面有巨大潛力。
以CRISPR-Cas9為代表的基因編輯工具，通過氣管內遞送到肺部細胞，是一種極具潛力的治療先天性肺部疾病的方法。目前，已經使用腺相關病毒（AAV）在人體內進行了基因編輯治療。
然而，AAV載體遞送Cas9的DNA在體內的長期表達，雖然提高了成功編輯的效率，但也會導致脫靶編輯的積累。此外，AAV衣殼的免疫原性限制了其重復給藥，更重要的是，AAV載體容量有限（不超過4.7kb），這導致其難以遞送編輯效率更高的spCas9。
而AAV病毒載體面臨的這些挑戰和限制，可以通過非病毒載體來遞送mRNA來解決，從而實現短暫表達和重復給藥，而且能夠突破載體容量限制。
脂質納米顆粒（LNP）是目前臨床試最先進的非病毒載體，隨著在新冠mRNA上的成功應用而被廣泛接受，在臨床試驗中，LNP遞送的Cas9 mRNA實現了肝臟遺傳疾病的有效治療。
然而，目前還沒能通過吸入的方式利用LNP遞送系統在體內進行高效的肺部基因編輯。與肝臟相比，肺部特殊的細胞類型、粘液屏障和粘液纖毛清除系統對吸入遞送提出了獨特的挑戰。此外，相比于mRNA疫苗，基于mRNA的基因編輯對LNP的遞送效率要求更高。
2023年3月，加拿大核酸疫苗與治療研究主任（Canada Research Chair），多倫多大學藥學院助理教授李博文聯合麻省理工學院教授 Robert Langer、Daniel Anderson 和麻省大學醫學院教授高光坪，薛文等人在 Nature Biotechnology 期刊發表了題為：Combinatorial design of nanoparticles for pulmonary mRNA delivery and genome editing（用于肺部mRNA遞送和基因組編輯的納米顆粒的組合設計）的研究論文，并與負責該論文審閱的編輯團隊和專家以Research Briefing形式對其主要研究結果共同進行了總結和展望：First lipid nanoparticle-enabled gene editing in the lung via inhalation。
利用高通量平臺，研究團隊合成和篩選了可生物降解的可電離脂質組合文庫，以構建用于遞送mRNA和CRISPR-Cas9基因編輯器的吸入式遞送載體。并從中篩選和鑒定了RCB-4-8 LNP，這種領先的脂質納米顆粒（LNP）具有更好的生物可降解性和安全性，可重復氣管內給藥。它提供了全球首個成功利用LNP實現高效肺上皮細胞基因編輯的方法，為先天性肺部疾病的基因治療開辟了新的途徑。
在這項研究中，研究團隊設計了一個三組分反應（3-CR）體系，其中硝基蓖麻油酸丙烯酸酯（NRA）連接劑與脂肪醇（脂質尾）偶聯，然后與含有伯胺、仲胺或叔胺的頭部基團連接。與傳統的將胺類頭部基團直接與脂質尾結合的雙組分反應相比，該三組分反應（3-CR）體系簡化了繁瑣的合成過程，增加了脂質結構多樣性，快速生成了結構多樣化的生物可降解電離脂質組合庫。
研究團隊合成了一個包含新的720種不同脂質的文庫，由10個不同長度脂質尾和72個不同頭部基團通過NRA連接子連接構成。該脂質文庫中所有的可電離脂質都含有大量的酯類和碳酸鹽基團，以提高可電離脂類的生物降解性，這有助于減少潛在不良反應，增強了與多劑量方案的兼容性。
通過體內動物實驗和體外細胞實驗的篩選，研究團隊發現，RCB-4-8 LNP在體內顯示出對肺部最高的轉染效率（遞送Luciferase熒光素酶的mRNA），并在體外顯示出最高的基因敲除效率（遞送CRISPR-Cas9系統mRNA組分）。
之前的研究顯示，使用陽離子脂質DOTAP替代DOPE，可有效提高全身給藥后LNP在肺部的轉染效果。在這項最新研究中，研究團隊使用DOTAP重新配置了RCB-4-8 LNP，結果顯示，其氣管內給藥遞送Luciferase熒光素酶的mRNA后在肺部表達效率得到了進一步改善，這可能是新的陽離子脂質組成可以增強LNP的肺細胞內化和粘液駐留。
此外，與直接使用移液管混合的LNP配置方式相比，通過微流控技術產生的LNP具有更小的尺寸，更低的聚合物分散性指數（PDI）和更高的封裝效率。
進一步的劑量反應實驗顯示，相比FDA已批準的MC3-LNP（為Alnylam公司2018年獲批RNA藥物ONPATTRO?中所使用的LNP），RCB-4-8 LNP對肺部的轉染效率提高了約100倍，相比近期開發的一款靶向肺部的新型LNP【2】，RCB-4-8 LNP對肺部的轉染效率提高了10倍以上。
此外，在給藥48小時后，RCB-4-8 LNP在肺中保留量<30%，而mc3-lnp則>90%，這表明表明RCB-4-8 LNP的潛在毒性較低。
接下來，研究團隊在Ai9 tdTomato小鼠模型中檢驗了RCB-4-8 LNP遞送Cre重組酶mRNA（Cre-mRNA）介導的體內基因編輯的效果，結果顯示，RCB-4-8 LNP遞送的Cre-mRNA在氣道中實現了良好的基因編輯效果，而且，三次給藥進一步增加了基因編輯效果，這表明RCB-4-8 LNP可以重復給藥，這與現在常用的AAV病毒載體相比是一個非常顯著的優勢。
同時研究表明，RCB-4-8對纖毛上皮細胞（a-Tubulin+）和Club上皮細胞（CCSP+），這兩種先天性肺部疾病的主要發病細胞，都可以實現高效的基因編輯。
接下來，研究團隊在Ai9 tdTomato小鼠模型中探索了使用RCB-4-8 LNP向肺部遞送CRISPR-Cas9組分的可行性。不同劑量的LNP與AAV5遞送相比，高劑量RCB-4-8 LNP遞送Cas9 mRNA后編輯效率與最近報道的雙AAV載體介導的Cas9的編輯效率相當。而LNP遞送mRNA的瞬時性能夠避免AAV遞送Cas9的長期表達帶來的脫靶性等潛在風險。
總的來說，這些令人信服的實驗結果證明了RCB-4-8 LNP在肺中實現CRISPR-Cas9基因編輯方面的巨大潛力。
綜上所述，該研究合成并評估了一個可生物降解的可電離脂質文庫，其中RCB-4-8 LNP被鑒定為能夠實現高效的肺部mRNA遞送和基因編輯。與基于AAV病毒的DNA遞送系統相比，LNP遞送mRNA的半衰期相對較短，從而減少了Cas9長期表達積累脫靶效應的潛在風險。此外，與AAV病毒載體不同的是，LNP可以重復給藥，這對于在肺部達到治療性基因編輯水平可能是至關重要的。
與mRNA疫苗相比，基于mRNA的治療藥物和基因編輯的發展路徑面臨額外的挑戰。免疫接種只需要產生最少量的蛋白質，因為免疫系統可以通過細胞介導和抗體介導的免疫反應顯著放大抗原信號。相比之下，mRNA治療需要高達1000倍的蛋白質水平才能達到治療閾值【3】。此外，mRNA治療還需要作用于特定的靶通路、細胞、組織或器官，這對其遞送系統提出了更高的要求。
該研究已經證明了RCB-4-8 LNP的高效性，該納米顆粒可以將CRISPR-Cas9系統以mRNA形式高效遞送到肺中的纖毛上皮細胞和Club上皮細胞，證明了將mRNA用于治療各種肺部疾病，包括囊性肺纖維化（CF）的基因編輯治療的可行性和巨大潛力。
Nature Biotechnology 同期還配發了來自以色列特拉維夫大學的 Dan Peer 教授的題為：CRISPR editing in the lung with novel lipids 的“新聞與觀點”文章。
Dan Peer 教授指出，李博文等人使用改進的脂質納米顆粒（LNP）通過吸入式遞送可以在小鼠肺部細胞進行CRISPR基因編輯，這種方法有助于開發有效治療肺部疾病的基因編輯藥物，通過進一步優化，推動mRNA技術的臨床應用。他還表示，與傳統疫苗和療法相比，該mRNA-LNP平臺具有幾項明顯優勢，包括無細胞體系、可快速生產、高通用性，以及良好的安全性。