李漢杰博士等開發新型測序技術及揭示腫瘤T細胞的轉錄

　　腫瘤組織中免疫細胞的組成在免疫治療中起關鍵作用，然而人類腫瘤組織中免疫細胞的異質性和分化途徑還有待研究。李漢杰博士等通過對25名黑色素瘤患者腫瘤中免疫細胞的單細胞轉錄組測序和單細胞TCR測序分析，發現大量的CD8 T細胞的轉錄組呈連續性梯度分布，跨越了從“過渡態”到“功能失調狀態”的分化途徑。相反地，細胞毒性CD8 T細胞是相對罕見的，并且不與過渡態T細胞或功能失調T細胞共有TCR，表明它們獨立于過渡態和功能失調的細胞狀態。出人意料的是，他們發現并證明功能失調的T細胞其實是腫瘤內增殖最快的免疫細胞并且功能失調的強度與腫瘤反應性有關。他們的數據表明，先前被認為是“耗竭”的CD8 T細胞實際上在腫瘤微環境中是高度增殖，且動態分化的。

背景

　　旨在重新激活腫瘤特異性T細胞反應的T細胞檢查點阻斷療法革命性地改變了癌癥治療。然而，許多患者并沒有獲得長期的臨床效果，可見我們對這些療法的反應或抵抗機制的理解仍然不完整。最近的研究表明，癌癥中免疫細胞的異質性對免疫治療的效果有重要影響。

　　T細胞是腫瘤免疫微環境中的重要組成部分。腫瘤內T細胞除了效應T細胞，記憶，調節性T細胞，還有“功能失調”或“耗竭”狀態的CD8 T細胞群。這種功能失調的T細胞的特征包括喪失經典的CD8T細胞效應功能，如細胞毒性等【1, 2】。此外，人腫瘤中功能失調的T細胞分泌獨特的細胞因子【2】。以前的研究認為T細胞衰竭伴隨增殖能力的喪失，但最近的研究暗示人類腫瘤中高表達PD-1的T細胞具有增殖潛能【3, 4】。除了高水平的PD-1，功能失調的T細胞還高表達其它抑制性檢查點分子如TIM-3和LAG3。目前，圍繞以表達有抑制性檢查點分子的T細胞作為免疫治療效果的預測指標，還存有很多爭論。在老鼠模型中，高表達抑制性檢查點分子的T細胞似乎難以通過PD-1阻斷被重新激活【5, 6】。然而，最近研究表明表達高水平PD-1的功能失調的T細胞的豐度與肺癌患者對PD-1抗體治療的臨床效果相關【4】。

　　近日，以色列Weizmann Institute of Science的單細胞測序領域大牛Ido Amit實驗室（李漢杰博士為論文第一作者）和Amos Tanay實驗室，聯合Netherlands Cancer Institute的腫瘤免疫學界大牛Ton Schumacher在Cell上發表了題為Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma的研究論文，對25個黑素瘤患者的腫瘤內免疫細胞進行了單細胞轉錄組和單細胞TCR分析。他們的研究發現盡管不同免疫細胞亞型存在于大多數患者中，它們的相對豐度在不同患者中存在很大差異。值得注意的是，盡管豐度不同，所觀察到的CD8T細胞的的分化途徑確是高度保守的。

　　特別地，他們發現兩個相對獨立的CD8T細胞群，其中一群經由一個“過渡態”分化為功能失調的T細胞。這些功能失調的T細胞表達已知的（PD-1，LAG3）和新的（例如，ETV1，AKAP5，CSF-1, ZBED2）調節分子。通過整合單細胞T細胞受體（TCR）測序和轉錄組分析，他們發現在功能失調的T細胞群中，有很多T細胞的TCR序列是相同的，表明功能失調的T細胞存在大量的克隆擴增。此外，通過對細胞周期相關基因表達的分析和細胞周期的流式細胞術分析，進一步證明了這群功能失調的T細胞處于高度增殖的狀態。這種增殖能力主要存在于早期的功能失調T細胞，而更晚期的功能失調T細胞則失去了這種增殖特征。相反地，基于不同T細胞之間共有TCR的程度和基因模塊分析，細胞毒性CD8T細胞在TCR及轉錄組特征上均與功能失調的T細胞類群沒有聯系。總的來說，他們的數據表明功能失調的CD8 T細胞在腫瘤微環境中處于動態分化和高度活躍的狀態，而且很可能驅動著腫瘤特異性免疫應答。

結果

　　人黑素瘤中免疫細胞的轉錄組異質性

　　為了更好地了解黑色素瘤中免疫細胞的異質性，李漢杰博士等收集了來自25名黑色素瘤患者的總共46,612個腫瘤浸潤免疫細胞的數據，基于Ido Amit實驗室先前開發的單細胞測序技術【7】開發了能夠同時獲得單細胞轉錄組和單細胞TCR序列的新型單細胞測序技術。接著，他們開發并應用一種新的單細胞轉錄組分析方法, “MetaCell” 算法【8】。從單細胞轉錄組數據中鑒定出穩定且均質的細胞群（“metacells”），從而得到324個metacells的詳細轉錄組，這些metacells組成七個大群，包括T細胞、NK細胞、樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、B細胞和漿細胞。

　　T細胞在腫瘤內的轉錄組呈連續，梯度分布

　　分析顯示腫瘤中T細胞包含初始T細胞，以及具有不同分化程度的CD4和CD8T細胞。初始T細胞含有的mRNA量很少，主要表達IL7R，CCR7，轉錄因子TCF7，和一些管家基因。相反地，非初始T細胞類群中的metacells顯示出較高程度的轉錄組異質性。大部分（145 個metacells）的CD8T細胞可被細分為“過渡性” CD8T細胞（GZMK +），細胞毒性CD8T細胞（GZMH +）和大量功能失調的CD8 T細胞。功能失調CD8T細胞高表達免疫檢查點分子，如PD-1和LAG3。分析顯示在轉錄組的空間里這些不同CD8細胞類群之間的邊界是彌散的，表明轉錄組的梯度表達是導致T細胞異質性的原因之一。 CD4 T細胞亞群主要含有表達FOXP3的調節性T細胞（Treg），同時也包括濾泡輔助T細胞（由CXCL13標記），以及一群類似功能失調CD8 T細胞的CD4 T細胞亞群。

　　CD8T細胞群內的免疫檢查點分子表達水平呈連續的梯度分布

　　通過對所有CD8T細胞 metacells里的細胞進行基因表達分析，他們鑒定了一些共表達的基因模塊。這些基因模塊包括與細胞毒性效應功能相關（GZMH，GNLY，FGFBP2和CX3CR1），或者與功能失調狀態相關（TIGIT，PD-1，LAG3和CXCL13）。有趣的是，細胞毒性和功能失調的兩個基因模塊之前是呈負相關的。基于這些數據，他們計算了兩個數值，一個量化功能失調基因模塊的活性（基因模塊錨定于LAG3），另一個評估細胞毒性基因模塊表達的總體強度（基因模塊錨定于FGFBP2）。然后，他們對所有CD8 metacells的“細胞毒性”數值和“功能失調“數值的分布進行比較，觀察到”過渡性“CD8T細胞與功能失調的T細胞是連續分布的。相反的，細胞毒性T細胞和“過渡態” CD8T細胞之間或其與功能失調T細胞之間的連續性很弱。

　　患者間功能失調的CD8 T細胞的豐度差異

　　緊接著，他們系統地分析了每位患者的免疫細胞組成。總體而言，大多數觀察到的T細胞類群在多數患者中都存在。這表明T細胞的轉錄狀態在不同患者之間有一定的保守性，但不同患者中不同免疫細胞類群的豐度是有較大差異的。特別地，CD8功能失調T在腫瘤浸潤性T細胞中的比例最低為3.6％，最高可達72.1％。

　　功能失調的CD8T細胞具有增殖能力且形成大的克隆

　　接著，李漢杰博士等整合了單細胞轉錄組和單細胞TCR序列分析。正如預期的那樣，TCR克隆組成在患者中差異很大。一些患者中TCR很多樣只有很小程度的克隆擴增，相反的一些患者TCR庫主要由少數大的克隆構成。有趣的是，較大的克隆顯示出功能狀態的不均勻分布，大的T細胞克隆主要由功能失調的T細胞組成。同時，患者中功能失調的T細胞比例與T細胞克隆性（clonality）呈正相關。為了進一步研究觀察到的克隆擴增是否可能是由于腫瘤內的T細胞增殖導致，我們通過細胞周期基因的表達水平來計算每個細胞的增殖分數，從而進一步計算不同細胞類群中增殖的細胞的比例。具體地，在功能失調的T細胞中觀察到最高比例的增殖細胞，其比初始T細胞增殖的比例高了近10倍。 Ki-67的流式細胞術分析驗證了功能失調的T細胞的增殖能力。在功能失調的CD8T細胞庫中，在獲得功能失調狀態程序的早期階段，增殖最為顯著。高度功能失調的T細胞的增殖能力的降低可能歸因于分化過程中增殖能力的丟失，或者由于高表達的抑制性受體抑制了細胞增殖。總之，克隆大小的增殖動力學和分布都支持黑色素瘤中功能失調的T細胞處于高度增殖和動態分化的狀態。

　　過渡性和功能失調的T細胞共有相同的TCR

　　通過不同細胞類群之間TCR共有的程度，可以推斷腫瘤中T細胞的譜系結構。TCR相同的T細胞一般屬于同一類群。如預期的，CD8或CD4T細胞之間不共有TCR。為了系統地分析不同T細胞類群之間TCR的共有情況，他們計算了不同類群間TCR共有的程度，并與隨機模型相比較，計算出一個TCR共有的富集值。正如所料，該數據顯示CD4細胞和CD8細胞之間分離得非常清楚。更有趣的是，觀察到過渡性CD8和功能失調細胞的有高水平的TCR共有，而與細胞毒性T細胞則沒有。

　　通過對來自3名黑色素瘤患者的外周血免疫細胞進行了單細胞測序分析，他們發現病人外周血中完全缺乏功能失調的T細胞，但存在大量初始，過渡性和細胞毒性CD8 T細胞。這說明功能失調的T細胞是在腫瘤內部進行持續的分化和增殖的，它們的分化與細胞毒性T細胞的分化在時空上是獨立的。

　　功能失調相關基因的表達水平和功能失調T細胞的豐度與腫瘤識別相關

　　最后，為了進一步研究不同T細胞類群的腫瘤特異性，作者對10名患者的T細胞進行體外擴增，并測試擴增后T細胞對患者自體來源的腫瘤細胞的反應（下圖）。

　　通過IFNγ和TNFα的表達來表征T細胞中是否存在腫瘤特異性的T細胞。在十個患者中有六個患者的T細胞能夠識別腫瘤。通過CD8T細胞內功能失調基因表達水平對患者進行排序時，他們觀察到對自體腫瘤細胞具有反應性的T細胞通常顯示出更顯著的CD8功能失調狀態。這相關性暗示，功能失調的T細胞是腫瘤特異性的，而細胞毒性T細胞不是。最近有研究表明，CD39和CD103高表達和KLRG1低表達是腫瘤特異性T細胞的特征，而在與腫瘤無關的旁觀者細胞中則低表達CD103，CD39，而高表達KLRG1. 與之相對應的，與細胞毒性T細胞類群相比，功能失調的T細胞類群的確顯示CD39和CD103的表達增加，及KLRG1的低表達。綜上，腫瘤特異性T細胞在腫瘤內部處于動態分化狀態，經過一個“過渡狀態”分化為功能失調狀態。

參考文獻

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