柱離心法純化質粒DNA實驗

實驗原理

1. 離心柱結構：特殊硅基質吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質穿過。

在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，形成了疏水環境。在此環境中，核酸與硅膠膜能有效結合，而蛋白質、代謝產物和其他污染物則不能結合。

2. 堿變性抽提的原理是在pH高于12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對，導致雙螺旋結構解開而變性，但閉環的質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當pH調至中性時，質粒DNA鏈迅速恢復到原來構型，仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再復性，通過離心，隨不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來，使兩者得以分離。

實驗試劑

1. 試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

2. 漂洗液

3. 結合緩沖液

4. 洗脫緩沖液

5. TE buffer

實驗設備

1. 吸附柱

2. 取液槍

3. 離心機

4. 低壓電泳儀

5. 水平電泳槽

6. 紫外透射儀

實驗材料

帶有質粒的大腸桿菌

實驗步驟

1. 培養細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應抗生素的液體培養基，37℃培養12～16小時；

2. 取液體培養液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混勻；置冰上；

3. 加入150ml 溶液II，加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置1-2min；

4. 加入150 m l  溶液III，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min；

5. 用臺式高速離心機，12000r/min離心10min；

6. 吸附柱中加入420ul 結合緩沖液，將步驟5中的上清轉移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻， 12000r/min離心1min；

7. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 靜置1 min，12000r/min離心30 s；

8. 重復步驟7一次；

9. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，12000r/min離心2min；

10. 吸附柱放入一個新的1.5ML離心管，在吸附柱的中央加40ul洗脫緩沖液或 TE buffer,室溫放置3-5分鐘。蓋好蓋子12000rpm 離心1分鐘，收集質粒DNA溶液。

11. 取5ul 電泳檢查，(100ml凝膠加入5ul 染料)。

注意事項

加樣時要排出槍頭中的空氣，以免攪動液面。