首次實現！非病毒、無質粒產生可表達抗CD19的CART細胞

　　美國應用DNA科學公司（Applied DNA Sciences,Inc.）近日宣布，旗下專注于下一代生物治療的公司LineaRx通過其專有的非病毒、無質粒（non-viral plasmid-free，NVPF）制造平臺在人類T細胞實現了抗CD19-CAR（嵌合抗原受體）的表達。據該公司稱，這一重大事件代表了利用經由可擴展聚合酶鏈式反應（PCR）制造過程產生的線性DNA設計的基因構建首次在人類T細胞表達抗CD19抗體。該公司認為，該技術將成為目前使用病毒遞送平臺的所有基因療法的一個重要選擇，尤其是使用病毒遞送合成基因來重定向患者T細胞的腫瘤免疫療法，即所謂的CAR-T療法。

　　Linearx公司獨特的基于PCR的制造技術創造了編碼抗CD19接合器的線性DNA擴增子，然后將該DNA構建體在體外通過電穿孔技術遞送至人類T細胞。隨后的測試證實，這些工程化T細胞實現了抗CD19 CAR的表達。盡管這些初步數據令人鼓舞，但總體表達水平較低，目前Linearx公司正在繼續使用正在申請ZL的高表達擴增子技術（HEA）和除電穿孔外的轉染方法來產生較高的轉染水平，并將在之后報告這一重大成果的進一步進展。

　　應用DNA科學公司總裁兼首席執行官James A.Hayward博士表示，“我們的目標有三個方面：1）確定PCR生產的線性DNA作為一個平臺用于快速設計和生產治療性核酸構建體的價值，包括床旁（POC）應用；2）證明NVPF生產流程改善的安全性和治療價值，該流程不同于目前全行業基于病毒的生產流程；3）與未來的合作伙伴一起，將我們開發的基于NVPF的抗CD19 CAR-T細胞療法推進臨床。

PCR產生的GFP基因片段在人類T細胞中的表達

　　這項成果建立在2018年底通過LineaRx公司PCR技術生產、設計、制造的線性DNA擴增子在工程化人類T細胞的第一個實例基礎上。該實例首次證明了一種包含可編碼綠色熒光蛋白（GFP）完整基因的線性DNA擴增子。如上圖所示，通過高通量電穿孔技術，PCR產生的GFP基因片段在數百個人類T細胞中被攝入及隨后表達，形成了綠色熒光細胞群。

　　2018年10月，Linearx公司宣布與Icell Gene Therapeutics簽署了一項針對抗CD19 CAR-T療法的北美獨家許可和研究服務協議。結合Applied DNA公司在大規模PCR生產和DNA化學修飾方面的專業知識，該公司將利用其NVPF平臺開發和生產表達載體用于多款CAR-T療法，包括LinCART19，這是一款非病毒、無質粒的抗CD19 CAR-T候選藥物。

　　正如2018年12月Linearrx公司在分析師日所討論的那樣，在中國開展的一項臨床試驗中，LinCART19所基于的CAR-T基因構建體在單次低劑量治療后6個月，所有3例急性淋巴細胞白血病（ALL）患者均實現完全緩解。雖然這些有希望的臨床結果為所使用的基因構建體提供了價值證據，但CAR-T細胞是通過病毒載體進行轉染的。LinCART19將使用線性DNA，并通過電穿孔、增溶或其他方式導入T細胞，其所針對的CD19是幾乎所有B細胞惡性腫瘤中表達的細胞表面蛋白，這也是目前已上市的兩款CAR-T療法的靶點。

　　在不使用病毒載體或質粒的情況下，Linearx公司的NVPF制造平臺比現有的基于病毒/質粒的CAR-T方法具有許多潛在的優勢包括：1）簡化的制造流程將降低成本和交付周期；2）降低永久性遺傳整合/重組進入靶細胞的風險，降低插入誘變的風險；3）細胞因子風暴治療副作用的潛在緩解；4）靶向新抗原的最終能力足以快速影響患者；5）避免復雜和繁瑣的分布式供應鏈，加速治療。

　　Linearx公司認為，NVPF方法能夠生成重要的生物治療藥物，有望重新定義“床旁”治療，為患者提供更快速、更有效、更經濟和更安全的基因治療，將個性化癌癥療法從夢想變為現實。