樹突細胞的分離實驗（二）

1.將2 管 I m l 的 4000U /m l 膠 原 酶 D 稀 釋（足夠用于2 0 個脾臟）： Im l 加 入 9m l H B S S(稀 釋 至 400U /m l ，步 驟 8 使用）， I m l 加 入 39m l 的 H B S S (稀 釋 至 100U /ml)。置

于冰上。

2 . 將 22 G 針頭連接在I O m l 的注射器上，充 滿 l O O U / m l 的膠原酶。將 I O m l 的 l O O U / m l溶 液 加 人 I O O m m 的培養皿中。

3 . 取另外一個直徑I O O m m 的培養皿進行操作。一只手拿鑷子，另一只手拿注射器，拇

指放在活塞上。用 鑷 子 夾 住 小 鼠 脾 臟 ，用 針 頭 刺 入 脾 臟 被 膜 的 狹 窄 邊 緣 ，注入100U /m l 膠 原 酶 100/xl。用鑷子將脾臟推向針頭，使針頭前進幾毫米。重復注射膠原酶 ，繼續直到I m l 膠原酶都注射入脾臟，針頭從另一端刺穿脾臟。

4 . 用針頭撕開脾臟，將其轉移至含膠原酶的培養皿中（步 驟 2)。重復操作，直到所有脾臟都注射和撕開。

5 . 從第二個培養皿中收集細胞懸液加入到置于冰上的50m l 離心管中。用 3m l l 00U/ml的膠原酶漂洗培養皿后加到上述50m l 離心管中。

6 . 加 入 3ml l 00U /m l 膠原酶至培養皿中。將撕碎的脾臟依次轉移至培養皿。用 2 個鑷子將它們撕成邊長I m m 的小碎塊，使其能通過5m l 吸管的內徑。當所有的脾臟都撕碎 后 ，將先前放置脾臟碎塊的培養皿中的膠原酶溶液加入進來，用 5m l 吸管猛烈吹打多次。

7 . 傾斜培養皿，將大塊碎片除開，將細胞懸液轉移至第5 步的置于冰上的50m l 離心管中。用幾毫升lOOU/m l 的膠原酶洗滌培養皿后加入至離心管中。

8 . 在培養皿留下的脾臟碎塊中加入IOml 400U /m l 的膠原酶。吹打數次后于培養箱里放置 30?90 min。

9 . 在孵育的最后階段，猛烈吹打碎片， 將其吸至直徑I O O m m 培養皿的無菌鋼網上。

10.用鑷子固定鋼網一端，用 幾 毫 升 lOOU/m l 膠原酶洗滌碎塊，然 后 用 無 菌 的 5m l 注射器活塞碾磨碎塊。搗爛直到所有的紅色物質從組織中去除。再用幾毫升lOOU/ml膠原酶洗滌鋼網。

11.將鋼網從培養皿中拿開，丟棄無色的黏附的被膜碎塊。猛烈的吹打培養皿中的液體 ，將其轉移至步驟7 的 50m l 離心管里。用 幾 毫 升 l O O U / m l 膠原酶洗滌培養皿后一同加入到離心管中（約 有 0 . 5 % 為樹突細胞或者更少）。

12.如果需要，即可用高密度的B S A 離 心（見基本方案1)。

基 本 方 案 2 用 小 鼠 骨 髓 前 體 細 胞 培 養 樹 突 細 胞（DC)

此 方 法（Inaba ， 1 9 9 2 ) 克 服 了 組 織 中 可 利 用 的 「內 源 性 A P C 」數量的有限性 。 一 旦培養成功，大量 的 D C 可用作細胞生物學的研究、遺傳性狀修飾、體內免疫。此種方法在研究D C 分化的生物學中也非常重要。

材 料（

6?7 周 齡 小 鼠（最好為雄性鼠，因為它們的骨頭比較粗大；運輸后需要休息至少5天 ；不要使用應激或脫水的老鼠）

7 0 % 乙醇

冰冷的以及室溫的R P M I -1640培 養 基（如 Life Technologies)

氯化銨溶液 〇? 02mol/L Tris ? C U p H 7. 2 (附錄I) /0?14mol/L N H 4Cl

裂 解 淋 巴 細 胞 的 抗 體（雜交瘤上清）（可選）。例 如 ，雜 交 瘤 R A 3-3A 1 (B 2 2 0 抗體 ； A T C C 號 TIB146)、 G K 1.5 (C D 4 抗 體 ； A T C C 號 Tffi 207)、 3.155

(C D 8 抗 體 ； A T C C 號 TIB211)、 M 5/114 ( M H C I I 抗 體 ； A T C C 號TIB1 2 0 ) —見 單 元 1. 3

兔 補 體（Pel-Freez)

R P M I -5完全培養基

小鼠G M - C S F (m G M -C S F ) : 可以來源于純化的重組蛋白，也可來源于轉染小鼠G M - C S F 基 因 的 細 胞 系 的 條 件 培 養 基（瑞 士 巴 塞 爾 A . Lanzavecchia博士贈送）

用 于 流 式 細 胞 檢 測 D C 的 抗 體 ：如 M H C I I 類 分 子 的 雜 交 瘤 上 清（A T C C 號TIB120)、 B 7-2/C D 86 的 雜 交 瘤 上 清（Pharmingen)、 D E C -205 的 抗 體( A T C C 號 H B 290)

解剖用品

無菌紗布墊

I O O m m 培 養 皿（如 Falcon)

3 ml 注射器 25 G ， 5/8in (1.58c m ) 針頭

9in (23c m ) 巴 氏 吸 管（填充棉花并高壓滅菌）

Nytex 濾 器（3-40/26; Tetko)

15m l 和 50m l 聚丙烯錐底管

2 4 孔 培 養 板（如 Corning)

1 . 取小鼠股骨和脛骨，保存在置于冰上的R P M I -1640培養基中，直到所有的小鼠準備完畢。去除骨頭上的肌肉（通常在無菌紗布墊上操作）后 ，將干凈的骨頭置于新的平皿里。然 后 在 含 7 0 % 乙醇的培養皿里浸泡骨頭2 min，最 后 用 冷 R P M I -1640培養基 洗 滌 2 遍 。

2 . 用 剪 刀 減 去 骨 的 兩 端（骺）然后將其轉移到另外的培養皿中。用 注 射 器 吸 取 2 mlR P M I -1640培養基沖洗骨髓腔以獲得骨髓。在另一培養皿里剁碎骨骺。將剁碎的骨骺以及從骨髓腔里沖洗出來的骨髓混合在一起，用吸管打碎團塊，將懸液通過篩網(去除顆粒）后 收 于 15m l 或 者 50m l 的離心管里。

3.加入3?I Oml 的氯化銨溶液裂解紅細胞。室溫靜置3m i n 后 ，室溫， 280 g離心IOmin(1200r/min Beckman G H -3. 7 轉子），棄上清。

4 . 去 除 淋 巴 細 胞（可選）：將細胞配成I X l O 7 個細胞/m l ，加入合適濃度的雜交瘤上清(通常1 : 2 0 終濃度）和 兔 補 體（通 常 1 : 17?1 : 2 0 終濃度）。 37°C 水浴培養lh，每

20m i n 振蕩一次。

作者 用 了 B 220抗 體（雜交瘤R A 3-3A 1)、 C D 4 抗 體（雜 交 瘤 G K 1. 5)、 C D 8 抗體（雜交瘤3.155)和1MCHII抗 體（雜交瘤M5/114)。

5 . 用 R P M I -1640洗 滌 骨 髓 細 胞 2 次 ，室 溫 ， 280 g 離 心 l O min。 計 數 活 細 胞（附錄3 0 。 用 R P M I -5完全培養基調整細胞濃度至I X l O 6 個細胞/m l 。

6 . 加入小鼠重組G M -C S F 至終濃度為700?lOOOU/m l 或 者 20ng/ml。將細胞懸液一般每只小鼠可以得到4 X 107?5 X 107 個 骨 髓 細 胞（沒有去除淋巴細胞）按 Iml/孔接種

2 4 孔板。

7.每兩天洗滌細胞一次，每次移出舊的培養基，然 后 傾 斜 2 4 孔 板 用 R P M I -1640輕輕地沿孔壁洗滌細胞后吸出洗滌液，最 后 加 入 I m l 新 的 含 700?lOOOU/ml (約 20ng/ml) m G M - C S F 的 R P M I -5完 全 培 養 基（步 驟 6)。

8.可選：驗證聚集物的特征—M H C II類分子存在于不成熟 D C 的 胞 內 小 室（M H CII小室或者MIIC) 通 過 標 記 [3 H ] 胸腺嘧啶，可 發 現 1 0 % ?2 0 % 的細胞處于S 期 ，用 流 式 細 胞 儀（單 元 4,1和單 元 4. 2 ) 分析，細胞中度表達膜M H C II類分子，但是

不 表 達 B 7-2/C D 8 6 共刺激分子。到 第 6 天 ， 培 養 板 孔 中 布 滿 很 多 聚 集 體 或 者 球 形 的 處 于 增 殖 期 的 非 成 熟 D C 。

9.在 第 5?8 天 期 間（此時已產生足夠的聚集體），用 R P M I -1640或 R P M I -5培養基輕輕吹打，將聚集體從貼壁的基質細胞上脫離下來（此后幾天一直會有聚集體產生）。收集脫離的細胞，室溫， 280 g 離 心 lOmin，棄上清。用 R P M I -5培養基重懸，最高

濃 度 為 I X l O 6 個細胞/ml。然后鋪在直徑為I O O m m 的培養皿中，每 個 培 養 皿 10m l ，最 多 鋪 I X l O7個細胞。

10.于細胞轉移后24?48 h 期間 ，每 24 h 輕輕搖晃培養皿，收集非貼壁、非增殖、成熟的 D C ，轉移至另外的收集管中用于后期的研究。

11.計 數 活 細 胞（附 錄 3 0 。用 流 式 細 胞 儀（單 元 4 . 1 和 單 元 4. 2 ) 或者用血球計數板(附錄3C ) 計 數 大 的 形 狀 不 規 則 的 細 胞 來 檢 測 D C 得 率 （每 只 動 物 通 常 獲 得 5 X IO6?IOXlO6個細胞，> 6 0 % 表達成熟D C 的表面標志）。