核酸親和層析法純化蛋白質實驗

實驗方法原理

DNA 偶聯至溴化氰活化的 Sepharcse 4B 是通過它們本身的堿基實現的。從理論上講，該方法也許干擾最佳結合序列的接近路徑，但是這樣一個簡單的方法一直被廣泛地成功應用。偶聯效率的定量檢測可經 A260 值測定評估，或者更精確地從偶聯介質上水解核酸和進行磷酸鹽測定。

實驗材料 寡核苷酸

試劑、試劑盒 HClKCl乙醇胺-鹽酸磷酸鉀緩沖液 儲存緩沖液

儀器、耗材 燒結玻璃漏斗聚丙烯試管

實驗步驟

1. 混懸 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中，室溫靜置 30 min 約可獲得 5 ml 溶脹的膠。經燒結玻璃漏斗過濾，當水分濾盡而溶脹的膠仍是潮濕的時候，立即停止抽濾；

2. 膠在漏斗內，依次用 4℃，200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L，pH 8.0 磷酸鉀緩沖液清洗；

3. 將膠移入含 2 ml 10 mmol/L，pH 8.0 磷酸鉀緩沖液的 15 ml 試管內；

4. 加 50 ul 寡核苷酸到試管，約每 ml 膠需用 2nmol 寡核苷酸。室溫下振搖 16 h；

5. 再移入燒結玻璃漏斗，抽濾除去液體；

6. 先后用 200 ml 水和 100 ml 1 mol/L，pH 8.0 乙醇胺-鹽酸清洗；

7. 將膠移入聚丙烯試管，在 7 ml 1 mol/L，pH 8.0 乙醇胺-鹽酸中混懸。室溫下搖 4～6 h。該步驟滅活未偶聯的活化的膠；

8. 在燒結漏斗中，依次用下述溶液洗膠。100 ml 10 mol/L，pH 8.0 磷酸鉀緩沖液；100 ml 1 mol/L，pH 8.0 磷酸鉀緩沖液；100 ml 1 mol/L KCl；100 ml H2O；100 ml 儲存緩沖液（10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl，0.3 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.02％ NaN3；

9. 4℃可儲存一年。