從牛舌或牛口鼻部分離橋粒
分級分離橋粒
| 實驗材料 | 牛口鼻部或舌頭 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 檸檬酸緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 勻漿器 |
| 實驗步驟 | 1. 在當地屠宰場獲取新鮮的牛口鼻部或舌頭，立刻埋于碎冰中。 對于口鼻部：用剃刀刮掉口鼻部最外面的一層（角質層的角膜），收集下面的一層（棘層）。 對于舌頭：從結締組織的上面分解出表皮。 2. 用剪刀將解剖來的表皮剪成 0.5 cm X 0.5 cm 的碎片。用一個 Polytron 勻漿器勻漿表皮，每 10 g 組織加 200 ml 含 0.05% NP-40 的檸檬酸緩沖液。在 4℃ 攪拌勻漿物 1 小時。 檸檬酸緩沖液： 0.1 mol/L 檸樣酸（pH 2.6) ( 用 1 mol/L NaOH 調 pH 值） 0.1 mmol/L DTT 5 μg/ml 亮抑蛋白酶肽（Sigma） 5 μg/ml 抑胃酶肽 1 mmol/L PMSF 3. 用一塊 50 μm 的尼龍網篩或網紗過濾勻漿物。 4. 濾過液用 13000 g 4℃ 離心 20 分鐘。 5. 用含 0.01% NP-40 的檸檬酸緩沖液重懸沉淀（每 10 g 表皮用 80 ml)。每間隔 10 秒超聲 15 秒共超聲 10 次，這將把橋粒與連接的細胞膜和其他細胞內成分分開。 6. 750 g 4℃ 離心 20 分鐘。 7. 去掉沉淀，上清用 12000 g 4℃ 離心 20 分鐘，沉淀包括由細胞碎片和細胞核組成的位于下面的灰色層和主要包括橋粒的位于上面的白色層。 8. 用含 0.01% NP-40 的檸檬酸緩沖液重懸上層的沉淀（每 10 g 表皮用 80 ml），12000 g 4℃ 離心 20 分鐘。 9. 重復第 8 步兩次，收集最終的沉淀。 |