植物體內可溶性蛋白質含量的測定(考馬斯亮藍法)

植物體內的可溶性蛋白質大多數是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標。在研究每一種酶的作用時，常以比活（酶活力單位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內可溶性蛋白質是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍G-250染料結合法。本實驗將分別介紹這兩種方法。

【原理】

考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在游離態下呈紅色，當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白質濃度范圍內（0～100μg/ml），蛋白質－色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質含量，所以是一種比較好的蛋白質定量法。

【儀器與用具】

分光光度計，10ml量筒1支；研體；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度試管14支。



【試劑】

（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考馬斯亮藍G-250：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個月；

（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。

【方法】

1.標準曲線的繪制

（1）0～100μg/ml標準曲線的制作取6支試管，按表28-1數據配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。準確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉混合數次，放置2min后，在595nm下比色，繪制標準曲線。

表28-1配制0～100μg/ml血清白蛋白液

（2）0～1000μg/ml標準曲線的制作另取6支試管，按表28-2數據配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。與步驟（1）操作相同，繪出0～1000μg/ml的標準曲線。

表28-2配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定吸取樣品提取液0.1ml（樣品提取見各酶活測定），放入具塞刻度試管中（設兩個重復管），加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過標準曲線查得蛋白質含量。

3.結果計算

樣品蛋白質含量（mg/g鮮重）=

式中C－查標準曲線所得每管蛋白質含量（mg）；

V－提取液總體積（ml）；

a－測定所取提取液體積（ml）；

W－取樣量（g）。