植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析

實驗概要

掌握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項。大分子量DNA分子的酶切分析。

實驗原理

十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L  NaCl）是可溶的,當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3 mol/L  NaCl)時,從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

主要試劑

1 、DNA extraction ：500ml 31.885g  sorbitol (山梨醇)  6.05g    tris   PH8.2  (一般不調)
  2、Nuclei lysis buffer:  500ml 100ml       1M  Tris PH7.5 100ml       0.25M  EDTA 200ml       5M    NaCl 10g         CTAB 100ml       ddH20
  3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽)  500ml 用時，將上述三種溶液按1：1：0.4 比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/l）,65℃預熱，既為抽提液。

實驗步驟

一、基因組DNA提取 1、取0.15g左右小麥葉片，在液氮中迅速研磨后放入1.5ml離心管中，加入700ul抽體液（65℃預熱）混勻， 65℃水浴裂解40-60 min，期間溫和混勻幾次，加4 ul RNase 室溫靜置2min。 2裂解好的DNA ，加入500 ul 氯仿：異戊醇（24：1），緩慢混勻，4℃×11 000rpm×10min。 3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預冷異丙醇，緩慢混勻后再猛烈混勻，使DNA成團，-20℃靜置30 min。 4、將析出的DNA 離心，4℃×11 000rpm×10 min。 5、去掉上清，將沉淀用500ul 70% 乙醇清洗一次， 6、3000 rpm×1 min, 徹底揮發除去乙醇，溶于40ul ddH2O。
 
二、酶切及電泳分析

37℃反應4h，迅速加入2 ul EDTA中止反應。0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點樣）。