武漢大學開發納米孔測序法，較qPCR陽性率檢測率提升43.8％

　　2019年底爆發新型冠狀病毒性肺炎COVID-19疫情，全球已有許多感染和死亡病例，截止2020年3月1日，累計確診超8萬人，死亡近三千例，但仍存在許多臨床疑似病例無法確診。既往COVID-19診斷依賴于qPCR核酸檢測，但是該方法顯示出較高的假陰性率和低敏感性（陽性檢出率僅為30％至50％），從而導致臨床高度疑似新冠感染患者或低病毒潛伏的“假痊愈患者”檢測“假陰性”現象頻發，此外，qPCR核酸檢測無法同時檢測其他秋冬季高發、癥狀與新冠相似的其他呼吸道病毒，給疫情防控和患者分流管理帶來極大挑戰。

　　身處疫區一線的武漢大學劉天罡教授、武漢大學人民醫院李艷教授、余鋰鐳教授、武漢臻熙醫學檢驗實驗室有限公司總負責人付愛思博士等組建的聯合團隊創新性開發了納米孔靶向測序（Nanopore Targeted Sequencing， NTS）檢測方法，2020年1月20日便在一線醫院開展工作， NTS結合了病毒靶向擴增和納米孔測序長讀長、實時數據輸出的優勢，首次實現測序后4小時內高敏感性、高準確性同時檢測SARS-CoV-2和其他10大類、40余種呼吸道病毒，其最低檢測限高于目前廣泛使用的qPCR的100倍。同時該方法還可實現對新型冠狀病毒基因組變異情況進行檢測，監控病毒變異引起的毒性與傳播能力改變的情況。

　　該團隊在2020年2月29日在預印版平臺medRxiv 投稿題為“Nanopore target sequencing for accurate and comprehensive detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses “的研究論文。

　　研究團隊平行測試了NTS和qPCR，結果表明：45個臨床高度疑似新冠感染患者的樣品，NTS共鑒定出34個陽性樣品，比qPCR多出15個；16個臨床已確診新冠感染患者中，NTS全部檢測陽性，qPCR僅9個陽性。臨床確診樣本顯示NTS比qPCR的陽性檢出率提升43.8%。除此之外，在這61個樣本中，原本qPCR鑒定為可疑陽性的18個樣本，利用NTS鑒定其中14例均為陽性， 此外，對于高濃度病毒樣本，NTS僅需測序10分鐘即可檢測陽性，即使極低濃度病毒樣本，也僅需測序4小時完成檢測，NTS的高敏感性、高鑒別性、高速度性，對鑒別臨床的疑似病例、助力疫情防控具有重大意義！

　　一、新冠確診問題引發的思考

　　疾病本身

　　早期臨床以發熱、干咳、乏力、影像學磨玻璃影等典型臨床表現作為COVID-19診療依據，但隨著對疾病的認識，諸多患者出現非典型癥狀、影像學表現和實驗室指標，個別患者甚至出現無癥狀感染，潛伏期延長至24天，在此期間，病毒可以從感染者傳播到未感染COVID-19的起病隱匿、潛伏期長、患者群體眾多等因素為臨床確診增加了難度。

　　截止2020年3月1日，國內COVID-19累計確診79,968例，死亡2873例，但仍存在851例臨床疑似但無法確診病例，國外累計確診7053例，累計死亡105例，疑似病例數據不詳。

　　目前檢測方法

　　qPCR方法：

　　僅針對病毒基因組上2-3個位點進行檢測分析，覆蓋<0.5%病毒基因組，樣本在采樣、存儲、檢測過程發生中稍有偏差，會導致僅針對少數基因位點的PCR檢測手段的效率降低，甚至漏檢，造成“假陰性”，且檢測區域一旦發生變異，會造成檢測結果失效。

　　 傳統基因測序方法：

　　宏基因組測序（mNGS）由于其技術操作復雜、儀器設備較大、檢測周期長等缺陷，絕大多數醫院無法獨立運用此技術開展常規檢測工作，而生物安全性的問題也使運輸到第三方醫學檢驗機構不具有操作性。

　　新冠特異性抗體IgM、IgG ：

　　新冠IgM特異性抗體：檢測患者感染的第7天后產生lgM抗體，18天后快速消失，受限于抗體產生的時間和載量。

　　新冠IgG特異性抗體：新冠感染后18天方顯著上升，且IgG陽性表明機體有感染，但不能區分是現癥感染還是既往感染。換言之，IgG陽性者可能是正在受感染者也可能是以前感染過，體內產生了抗體，是感染產生的痕跡。

　　簡而言之，核酸檢測的是病毒RNA（核糖核酸），是病毒存在的直接證據；抗體檢測是檢測患者血液中被刺激產生的抗體，是間接證據。

　　二、納米孔靶向測序的評估

　　方法學優勢

　　靶向擴增：

　　研究團隊開發的NTS技術不局限于中國或美國疾病控制中心（CDC）目前在qPCR方法中推薦的位點，而是將檢測范圍擴大到9個基因、12個位點，近10 kb區域，全面覆蓋病毒基因組上主要基因區域，100%覆蓋病毒基因組上毒力相關的重要基因，檢測病毒基因組范圍提升100倍，顯著提高檢測敏感性和準確性。

　　測序：

　　借助納米孔測序平臺的兩大優勢：可以對長核酸片段進行測序，并實時分析輸出數據。納米孔靶向測序可以在測序后幾分鐘至數小時確認SARS-CoV-2感染，同時，測序分析出的準確核酸序列可以表明在病毒傳播期間與毒力相關的基因是否發生了突變，從而迅速為后續的流行病學分析提供信息。

　　便捷：

　　納米孔測序平臺對實驗室要求不高，其中最小測序儀MinION是便攜式的，因此NTS也適合不同級別的醫院使用。NTS對于新冠病毒具有高敏感性、高準確性優勢，以及能夠區分新冠病毒和其他常見呼吸道病毒的特點，使其非常適用于疑似病例的診斷，特別是目前用其他方法無法甄別的病人的診斷。

　　最低檢測限：10 copies/mL

　　研究團隊使用了帶有COVID-19病毒S和N基因的標準質粒來模擬SARS-CoV-2，將標準質粒分別以10、100、500、1000、3000加入背景cDNA樣品，結果顯示：即使是最低10個拷貝/ml，當測序時間達到1小時時，10 copies/mL的測序數據與陰性對照有顯著差異（p<0.05），NTS的最低檢測限為：10 copies/mL。

　　檢測速度：測序最快實現10min

　　研究團隊在該實驗中證實高拷貝樣品（1000、3000 copies/mL）可以快速（＜10分鐘＝產生足夠的有效測序數據進行診斷，即使是最低拷貝樣品（10 copies/mL），4小時內也可獲得有效測序數據。最終，實現測序10分鐘數據用于快速檢測；4小時最終報告。

　　三、臨床研究

　　早期疑似新冠45例

　　研究團隊收集了45個疑似新冠感染的樣本，平行進行qPCR和NTS檢測，結果顯示：NTS在45個臨床高度疑似感染樣品中共鑒定出34個陽性樣品，比qPCR多出15個，NTS檢測靈敏度高于標準qPCR，在這61個樣本中，原本qPCR鑒定為可疑陽性的15個樣本，利用NTS鑒定其中11例均為陽性，顯著提高新冠檢測的陽性率和對可疑陽性患者的甄別能力。

　　確診新冠感染16例

　　研究人員對臨床已確診新冠感染（臨床診斷、既往核酸檢測）的住院患者平行進行NTS和qPCR檢測，結果顯示：

　　16個病例NTS全部檢測陽性，100%吻合，而qPCR僅9個陽性，56.2%吻合。NTS檢測陽性率提升43.8%。此外，3個qPCR可疑陽性均被NTS鑒定陽性，結果表明NTS在病毒處于低載量時，由于其高靈敏性，可顯著彌補qPCR造成的“假陰性”問題，輔助臨床得到準確、可靠的判斷！

　　病毒變異監測

　　qPCR方法無法提供病毒基因序列信息，難以系統的分析病毒溯源、病毒的傳播和變異演化的疫情防治與監控，而研究團隊開發的NTS檢測技術對19個來自門診患者，已用qPCR確認陽性的樣本進行了突變篩查，結果顯示：

　　在4個樣本中發現了7個位點的單核苷酸突變，與2020年2月8日之前在GISAID數據庫中報告基因組數據相比，NTS監測到的部分突變在GISAID被識別，部分突變未被識別，表明了NTS檢測到的突變在不同菌株中的多樣性，以及該病毒可能帶有現有基因組范圍的測序方法尚未表征的突變。

　　四、NTS拓展檢測：其他呼吸道病毒

　　目前，有肺炎和發熱癥狀病人感染的不僅是SARS-CoV-2, 區分不同類型的呼吸道病毒感染引起了全世界的關注。而當前臨床上使用的SARS-CoV-2 qPCR試劑盒無法識別共感染病毒的種類，同時qPCR的假陰性率較高，延誤了患者的早期分診，從而浪費了寶貴的醫療資源并增加了潛在的交叉污染。

　　研究團隊開發的NTS可檢測呼吸系統常見10大類，40余種呼吸道病毒，包括博卡病毒，鼻病毒，人間質肺病毒，呼吸道合胞病毒，冠狀病毒，腺病毒，副流感病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒和丙型流感病毒。研究團隊在檢測中已發現有病人同時感染了SARS-CoV-2和甲流病毒H3N2。

　　總結與展望

　　該聯合團隊創新性開發NTS檢測技術用于新型冠狀病毒肺炎COVID-19檢測與防控，同時具備以下特點：

　　1. 高靈敏：檢測低豐度的病毒，彌補qPCR檢測“假陰性”問題，助力早期診斷、提示早期感染風險。

　　2. 高速度：測序10分鐘快速檢測；測序4小時最終報告，全程從樣本送達到出具結果控制在6-10小時，首次基于測序平臺實現全程當天出具結果。

　　3. 檢測范圍廣：除新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）外，還可以檢測其他10大類、40余種呼吸道病毒引起的感染，分類管理，輔助快速確定診療方案。

　　4. 病毒信息全：可以同時實現病毒檢測和病毒突變情況監測，為疫情監測提供可進行詮釋和實時的流行病學信息。

　　5. 方法簡易便攜：適合在醫院和CDC等實驗室開展，在資源有限的環境中，可以快速使用和監控疫情。NTS對于新冠病毒具有高敏感性、高準確性優勢，以及能夠區分新冠病毒和其他常見呼吸道病毒的特點，使其非常適用于疑似病例的診斷，特別是目前用其他方法無法甄別的病人的診斷。