比色法蛋白質定量介紹

蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以最早期的 Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質與Cu2+反應，產生藍色的反應物。但是與 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含 EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產 生 Cu+，后者與 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm 波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩定。相對于 Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry 法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰 595 nm。其最大的特點是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定１小時，方便結果；而且與一系列干擾 Lowry，BCA 反應的還原劑（如 DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以 同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller 等測試人奶中的蛋白，結果 Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry 測試細胞勻漿中的蛋白質，以 BSA 作標準品，濃度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作標準品，濃度 2.64 mg / ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品 的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品 （包括標準樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外， 非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。