畢赤酵母遺傳霉素抗性轉化子的篩選

實驗概要

本實驗介紹了畢赤酵母遺傳霉素抗性轉化子的3種篩選方法。

實驗步驟

1. (去壁細胞)方法：從含HIS 轉化子的平板開始

   1) 用滅菌刮片將含有HIS 轉化子的頂層瓊脂最上層刮下，放入無菌的50ml 離心管中。

   2) 加入10-20ml滅菌水，量應為瓊脂的兩倍，劇烈振蕩1-2min。

   3) 將離心管置于管架上，讓瓊脂沉淀(1min)。

   4) 用血球計數計確定上清中細胞濃度。至少要5×10⁵細胞/ml，那樣在200ul 或更少溶液中可含10⁵ 個細胞。(如果太稀，可將液體轉入另一管中，離心細胞，再用適量滅菌水重懸至5×10⁵細胞/ml)。

   5) 每塊含遺傳霉素的YPD 平板涂105細胞。每個濃度用四塊板。(需要證實在沒有遺傳霉素的YPD 板上細胞的滴度，計算每個遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉化子的1-10%，將收集的轉化子稀釋到10^-5，10^-6，10^-7濃度，每板加100-200ul)。

   6) 在30 度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5 天出現，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現。接下來做結果分析。

2. (電轉化)方法：電轉化畢赤酵母時用以下程序。轉化子不需要鋪在上層瓊脂。從含HIS 轉化子平板開始。

   1) 吸取1-2ml 滅菌水于所有HIS 轉化子平板上。

   2) 用滅菌刮子重懸HIS 轉化子，不要劃破瓊脂。

   3) 將細胞懸液集中轉移至滅菌的50ml 離心管中，稍渦旋(5-10S)。

   4) 用分光光度計測定濃度(1OD600=5×10⁷細胞/ml)。

注意：混有瓊脂會干擾讀數

   5) 在每塊含有遺傳霉素的YPD 平板上涂10⁵細胞。(需要證實在沒有遺傳霉素的YPD 板上細胞的滴度，計算每個遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉化子的1-10%，將收集的轉化子稀釋到10^-5，10^-6，10^-7濃度，每板加100-200ul)

   6) 在30 度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5 天出現，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現。接下來做結果分析。

注意：如果在以上方法里你將所有細胞都懸浮，加15%滅菌甘油，存于-80度，可在以后時間里做遺傳霉素抗性篩選。

3. 方法：需要三組各兩塊微量測定板(共6 塊)來篩選180 個HIS 重組子。通過持續接種，得到相同濃度的克隆子，以確保遺傳霉素平板上細胞數相等。如將轉化子鋪于頂層瓊脂中，有必要從瓊脂上收集細胞，重新涂最小組氨酸平板(P42)以收集克隆。記住要有菌株背景對照及單拷貝基因對照。每180個克隆，可選擇出1-10個抗遺傳霉素克隆。

   1) 無菌條件下，在每個微量測定板上加入200ul YPD。

   2) 用滅菌牙簽在第一組平板中每孔接種單個HIS 轉化子，輕輕攪動以懸浮細胞。

   3) 蓋住微量測定板在30 度孵育2 天(不需搖動)。

   4) 2 天后，取新的微量測定板，加入190ulYPD。

   5) 用多道移液器吸取10ul 培養液于第二組測定板中，確保第二組板標記好并放置好，這樣可指示細胞所在孔。

   6) 蓋住第二組板，30度孵育過夜。

   7) 第二天，在第三組測定板上重復第5，6步。

注意：持續生長及傳代可使克隆達到相同細胞濃度。

   8) 孵育后，取第三組板，用100ul 多道移液器上下吹打重新懸浮細胞。

   9) 取10ul每孔中液體點在含遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5……4.0mg/ml 的YPD 平板上。用多道移液器或在平板底下劃線，確保以規則方式排列。

   10) 待液體吸收，將板放于30 度，2，3，4，5 天后檢測抗遺傳霉素克隆，接著分析結果。

注意事項

用遺傳霉素篩選可能會有假陽性。劃線挑取假定的抗遺傳霉素單克隆，然后在YPD-遺傳霉素平板上進行證實很重要。如果你真的選擇復制平板，一定要證實遺傳霉素抗性。開始前：準備10 個YPD 平板，每個的遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。