毛細管電泳儀在DNA分析中的應用

毛細管電泳儀簡稱毛細管電泳儀（CE），是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離，是分析科學繼液相色譜儀之后的又一重大進展，使分析科學從微升級進入到了納升級水平，不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能，也使蛋白質和核酸等生物大分子分析有了新的轉機。

一、微量DNA的檢測：

CE用于DNA分析首要的優點是可實現微量DNA的檢測。CE采用LIFD檢測，可從幾十納克的固相硅膠樹脂中檢測到所吸附的幾納克或幾皮克的DNA。CE可直接定量從若干白細胞或幾微升血液中提取的DNA，用于PCR擴增。當CE與PCR相連時，可檢測到2個拷貝的起始模板經20次循環后的擴增產物。當使用聚丙烯酰胺填充的毛細管和綠色氦－氖激光光源（激發光543nm，發射光600nm）時，利用內插試劑溴化乙錠（EB）可檢測到幾皮克的雙鏈DNA－EB復合物，而在瓊脂糖凝膠上用EB染色是不能分辨的。因此，CE極大地提高了DNA的檢測靈敏度，使檢測所需樣品量劇減。

二、DNA 片段的分離：

在大多數DNA分子標記技術中，分析和比較的依據是對DNA段進行有效和重現性的分離。CE在分離DNA段長度范圍、分離速度和檢測靈敏度方面有獨到的優勢。

1、如在基因物理譜圖和PCR產物分析中，采用低粘度的篩分介質（聚氧乙烯，25℃以下），不用脈沖電場，可分離80bp～40kb的雙鏈DNA段。CE分離DNA段大小范圍是平板電泳的10倍。

2、如在線粒體DNA的檢測中，利用持續變性CE，在180s內可分離300個單鏈DNA段。CE的分離速度是平板電泳所望塵莫及的。

3、CE分離速度的提高并不以降低分辨率為代價，相反其檢測靈敏度更高。如在梯度毛細管電泳條件下，當EB僅為1ng/mL時，可檢測分離出小于80bp的DNA段，而且458bp和504bp片段得到部分分離。因此，CE可替代平板電泳用于基于PCR的分子標記，還可用于基于限制性酶切片段大小的分子標記分析。CE快速、靈敏和的特點不僅使分子標記的重復驗證工作不再繁重，而且在一定程度上避免了硝酸銀染色和同位素標記過程中出現的假帶現象。

三、DNA突變的檢測：                                                                

CE不僅在以DNA段分離為基礎的分子標記中有獨到的優勢，還可用于DNA突變位點的自動檢測。CE采用單鏈構造多態性法與雙脫氧指紋圖譜法，可檢測DNA突變。

四、在臨床診斷中的應用：

CE在臨床診斷中的應用得到了飛躍式的發展，逐漸替代了常規檢測方式。

五、使微量PCR擴增及產物檢測整合成自動化體系：

微型硅膠PCR反應器與CE芯片可整合成DNA分析系統。β－球蛋白基因在15min內可從M13中擴增出來，然后在120s內在CE芯片上得到快速分離，使整個PCR－CE過程在20min內完成。而且從毛細管的出口處可收集經過分離純化的DNA段，該片段可轉移到正電荷膜上進行雜交。此方法可代替和簡化傳統的DNA段回收方式，自動化程度高，分離純度高。此外，由于毛細管出口小，片段易于在雜交膜上富集，皮克級DNA都能經雜交檢測到。這使PCR擴增、CE分離純化和DNA雜交三個過程實現集成化和系統化成為可能。

六、使高通量DNA分析和測序成為可能：

放射性陣列毛細管電泳微板與掃描儀聯用可實現高通量的DNA檢測。電泳微板包括一個普通中央陽極槽，與96個微型分離通道相連，使用激發的旋轉共聚焦掃描檢測器檢測四色通道，96個樣品采用壓力式毛細管陣列系統平行進樣，可使96個PBR322限制性內切酶片段在120s內得到分離。若同時使用40塊微板，每塊微板上有384個分離通道，則一次進樣量可達15000個，從而達到高通量DNA分析和測序的目的。此外，CE不僅可對DNA的合成片段進行純度檢驗，對PCR擴增的DNA模板進行純化和從反應體系中去除，還可進行文庫建立或復制，啟動子作用方式檢測自然和人工合成RNA的結構。

目前，生命科學領域的分析儀器正向著微型化、集成化和自動化的方向發展，高分辨率、快速、耗樣量少、低成本和高通量的毛細管電泳的應用前景將會非常廣闊。由于CE開發和應用的歷史不如色譜長，對于各種不同物質的分離技術和方法還不夠完善和成熟，在實際分析過程中需要花較長時間放在方法的建立上。