毛細管電泳原理及在藥學領域的應用

發布時間：2010-06-30 14:29 原文鏈接：毛細管電泳原理及在藥學領域的應用

　提要：高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPLC)是80年代后期發展起來的引人注目的新型分離分析技術，已廣泛用于蛋白質、氨基酸、核苷酸、無機離子、有機化合物、藥物的分離分析，并開始在中藥研究領域得到應用。本文主要闡述HPLC的基本原理、和在藥學領域中的應用，并對其在藥學領域中的應用前景作了展望。

　　關鍵詞：HPCE;毛細管電泳;原理

　　高效毛細管電泳(HPLC)亦即毛細管電泳(CE)，是一種發展迅猛的新型的分離分析技術，與常用的高效液相色譜法(HPLC)相比，具有分析時間短，分離效率高，適應性廣，檢測限低，進樣量小，溶劑消耗少，自動化程度高等優點，近十多年來已廣泛應用于蛋白質、氨基酸、無機離子、有機化合物、藥物的分離分析，在生物醫藥學領域倍受青睞。本文簡要介紹HPLC的基本原理、特點及在化學藥品分析、中藥分析、生物制品分析研究方面的應用，并展望其在藥學領域中的應用前景。

　　1、HPCE的基本原理

　　高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是近年來發展起來的一種分離、分析技術，它是凝膠電泳技術的發展，是高效液相色譜分析的補充。該技術可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析高效、快速、微量[1]。

　　1-1 電泳遷移

　　不同分子所帶電荷性質、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質及PH的緩沖液或其它溶液內，受電場作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。

　　電泳遷移速度(v)可用下式表示：

　　v=uE

　　其中E為電場強度(E=V/L，V為電壓，L為毛細管總長度)。u為電泳淌度。

　　1-2 電滲遷移

　　電滲遷移指在電場作用下溶液相對于帶電管壁移動的現象。特殊結構的熔合硅毛細管管壁通常在水溶液中帶負電荷，在電壓作用下溶液整體向負極移動，形成電滲流。帶電微粒在毛細管內實際移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。

　　1-3 分離分析類型

　　根據其分離樣本的原理設計不同主要分為以下幾種類型：①毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis，CZE);②毛細管等速電泳(capillary chromatography，CITP);③毛細管膠速電動色譜(miceller electrokinetic capillary chromatography，MECC);④毛細管凝膠電泳(capillary gelelectrophoresis，CGE);⑤毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing ，CIEF)。

　　毛細管區帶電泳(CZE)為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實驗條件包括緩沖液濃度、pH值、電壓、溫度、改性劑(乙腈、甲醇等)，用于對帶電物質(藥物、蛋白質、肽類等)分離分析，對于中性物質無法實現分離。毛細管膠束電動色譜(MECC)為一種基于膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質分子在水相和膠束相分配的差異進行分離，拓寬了CZE的應用范圍，適合于中性物質的分離，亦可區別手性化合物，可用于氨基酸、肽類、小分子物質、手性物質、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細管等速電泳(CITP)采用先導電解質和后繼電解質，構成不連續緩沖體系，基于溶質的電泳淌度差異進行分離，常用于離子型物質(如有機酸)，并因適用較大內徑的毛細管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細管等電聚焦電泳(CIEF)用于具兼性離子的樣品(蛋白質、肽類)，等電點僅差0.001可分離的物質。毛細管凝膠電泳(CGE)依據大分子物質的分子量大小進行分離，主要用于蛋白質、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細管電色譜(CEC)及非水毛細管電泳(CNACE)，用于水溶性差的物質和水中難進行反應的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來說明HPLC的原理。

　　1-3-1　CZE的基本原理

　　HPLC選用的毛細管一般內徑約為50μm(20～200μm)，外徑為375μm，有效長度為50cm(7～100cm)。毛細管兩端分別浸入兩分開的緩沖液中，同時兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移，當分離樣品通過檢測器時，可對樣品進行分析處理。HPLC進樣一般采用電動力學進樣(低電壓)或流體力學進樣(壓力或抽吸)兩種方式。在毛細管電泳系統中，帶電溶質在電場作用下發生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象;電泳是指在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象。溶質的遷移速度由其所帶電荷數和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質、pH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細管壁形成有機雙層向負極移動，帶負電荷的組分被分配至毛細管近中區域，在電場作用下向正極移動。與此同時，緩沖液的電滲流向負極移動，其作用超過電泳，最終導致帶正電荷、中性電荷、負電荷的組份依次通過檢測器。

　　1-3-2　MECC的基本原理

　　MECC是在CZE基礎上使用表面活性劑來充當膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質在水相、膠束相中的分配系數不同，在電場作用下，毛細管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時待分離物質在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術與色譜法的結合，適合同時分離分析中性和帶電的樣品分子[2]。

　　2、HPLC在各類藥物中的應用

　　藥品是與人們生命息息相關的特殊商品，檢驗其真偽或質量的優劣，需要先進、快速、準確的定性和定量手段。因此，HPCE分析技術很快即被藥物分析工作者在藥品檢驗領域迅速推廣應用[3、4]。國內自1989年起曾有學者報道，但研究和應用實例不多。近1～2年發展迅速，并取得了顯著成績。

　　2-1 化學藥品分析

　　化學藥品結構簡單、清楚，常規分析方法能基本解決定性、定量和純度控制等問題。但有些結構特異(如手性對映體結構)或性質特殊的品種，現代分析手段從靈敏度、分辨率和分析速度等方面，仍有一些難點。HPCE技術的特點、優勢，恰恰彌補和解決了某些分析手段的不足。應用實例有單體，也有復方制劑：

　　牛長群等[5]用HPCE 法，50mmol.l-1緩沖液(ph 8.3)，分離測定了氨芐青霉素的聚合物。大部分樣品以開環和閉環的二聚物為主要聚合體，可對多個組分進行定量，以控制此類致敏成分對氨芐青霉素的質量影響。李關賓等[6]用自制的CE-電化學檢測系統，對VC、VB1和VB6的CZE和MECC的分離與檢測表明，在0.01mol.l-1NH3- NH4CL介質中，檢測電勢510～540mV，3種維生素均得到較好的分離和CZE圖譜。李小戈等采用MECC，Na2B4O2-SD緩沖體系，4min內對5種水溶性維生素VC、VB1、VB2、VB6和VB12進行了有效分離，分辨率高，重現性好，令人滿意。廉經武等[7]以β環糊精的兩種衍生物作CE的手性分離添加劑，對鹽酸美西律的對映體進行分析。其中，2，6-0-二甲基β-環糊精可將對映體部分拆分，而用三甲基環糊精作手拆添加劑時，則可使對映體定量達到基線分離。俞琦等[8]用HPLC和二極管陣列檢測器，環糊精為拆分劑，含DM-β-CD40mmol·L-1、KH2PO470mmol·L-1(pH2.5)的緩沖劑，對氧氟沙星對映體進行了優化分離。張文江等[9]采用HPLC模式，選用4×10%-2mmol·L-1Tris-H2PO4(pH3.6)-6.5×10-2mol·L-1β-環糊精，分離了海南新堿衍生物HHO7A異構體，并應用于肝微粒體中代謝的查體選擇性研究。孫發山等[10]用HCZE模式，50mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH9。67)，取血漿直接進樣測定復方頭孢氨芐膠囊中頭孢氨芐的含量，只需樣品5μl，10min內一次完成，方法非常適合血藥濃度檢測。劉新宇等[11]以茶堿為內標，用KH2PO4-硼酸緩沖系統(pH8.5)，建立了泰諾復方感冒片中撲熱息痛、鹽酸偽麻黃堿、氫溴酸美沙芬、馬來酸撲熱息痛和苯甲酸鈉5種成分的含量測定方法，10min完成定量。

　　2-2　中藥分析

　　中藥品種繁多、藥材產地各異、成分復雜，無論是藥材還是成藥的分析，都是一項非常艱難的任務。中藥分析工作用現代化儀器設備和科技手段(如薄層色譜、HPLC等)雖取得巨大進展和成就，但往往只是對藥材和成藥成百上千個成分中的一個或幾個成分的分析，實際只是一種象征性的代表式分析，與之起化學和藥理效應的實際組合成分(起碼是有效成分)相比，仍有相當大的距離。隨著CE技術對中藥材及其有效成分的鑒別與分析的快速發展，建立在此基礎上的中成藥成分的定性、定量分析已有進展，且有希望解決長期困擾中藥質量控制中的重大難題。近年，報道HPCE 分析中藥材已有18種、成藥70種和有效成分120個以上。

　　LiuYM等采用CEC模式，85%0.1mol·L-1的乙酸鈉緩沖液加15%甲醇作流動相，13min內分離黃連中的小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己胺、藥根堿、加倫巴胺、木蘭花堿、黃連次堿。用50%0.2mol·L-1乙酸鈉加50%乙腈作流動相，8min可內分離黃連中的黃連次堿、小檗堿和巴馬亭。張國華等[12]則用65%NaH2PO4緩沖液加35%甲醇作流動相，分離了黃連中小檗堿、巴馬汀和藥根堿等7種生物堿。LiuYM等還用磷酸緩沖液5mmol、Ba(OH)2和20mmol異亮胺酸作緩沖液，pH10條件下10min分離了麻黃中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲基麻黃堿和去甲偽麻黃堿。改用10mmol·L-1頡胺酸作緩沖液時，僅用3min即分離了麻黃堿和偽麻黃堿。LiKL和ShenSJ以膽酸鈉作膠束，用MECC模式成功地分離測定了黃芩和黃連混合物中的黃連次堿、小壁堿、表小壁堿和巴馬亭4種生物堿及黃芩素等6種黃酮。又在20mmol·L-1SDS10mmol·L-1NaH2PO4系統中，加入12.5mmol·L-1硼砂，25min內分離了黃芩中漢黃芩素、漢黃芩素-7-O-葡萄糖甙、貝加因、貝加靈、木蝴蝶素A和木蝴蝶素A7-O-葡萄糖甙酸。宋玉英等[13]在25mmol·L-1SDS中，加入25mmol·L-13-環己氨基-1-丙基磺酸_乙腈作改性劑，分離測定了大黃、蘆薈中的大黃素、大黃酸等。國外有人用等束單電泳分離了大黃和番茄葉中的蒽醌類番茄甙A和B的含量。Chen等[14]用MECC模式，50%20mmol·L-1磷酸二氫鈉加20%乙腈，pH7.5，10min分離了甘草中甘草酸和甘草次酸。Iwagami則在0.1mol·L-1-SDS硼砂、磷酸緩沖系統中加入膽酸鈉，25min可分離混合提取物中的甘草酸和芍藥甙。

　　2-3生物制品分析

　　生物制品是醫藥藥品的重要組成部分，隨著DNA技術和克隆技術的應用，它的研制和生產成了醫藥行業的熱點。但其分子量大、結構復雜，較難鑒別和定量一直是阻礙其快速發展的因素之一。HPCE技術的應用正在逐步解決著這一難題。生物制品絕大多數由氨基酸、肽、蛋白質組成，HPCE技術主要是用CZE測定肽譜、SDS-CGE測定蛋白分子量和CE-MS直接測定分子量。步驟是將蛋白酶解或化學裂解成肽片斷，利用CEC分離后所得的電泳圖(稱HPCE肽圖)，根據蛋白一級結構和所用裂解試劑，給出不同特征的肽圖作指紋圖譜，并用作鑒別標準。還可通過各片段峰的收集和測序，用肽圖測定蛋白質的一級結構，鑒別種屬遺傳差異。

　　3、HPCE的特點

　　與傳統的電泳相比，毛細管電泳主要特點有四個：一是高效，二是快速，三是微量，四是可以自動化。在毛細管區帶電泳中，柱效一般為每米幾十萬理論板數，高的可達每米100萬以上，而在凝膠電泳中這一指標竟能達到幾百萬甚至上千萬，通常的分析時間不超過30min，在采用電流檢測器，毛細管電泳的最低檢測極限可達10-19，即使是一般的紫外檢測器，大體也在10-13-10-15mol之間，因此樣品用量僅為納升而已，商品儀器的操作已可全部自動化。

　　毛細管電泳和高效液相色譜(HPCE)一樣，同是液相分離技術，因此在很大程度上HPCE與HPLC可以互為補充，但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細管電泳都顯示了一定的優勢。與HPLC相比，毛細管電泳的柱效更高一些，速度更快一些，同時，它幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅為HPLC幾百分之一。HPCE沒有泵輸運系統，因此成本相對要低，通過改變操作模式和緩沖液的成分，毛細管電泳有很大的選擇性，可以根據不同的分子性質(如大小，電荷數，手征性，疏水性等)對極廣泛的對象進行有效的分離。相比之下，為達到類似目的，HPLC要消耗許多價格昂貴的柱子和溶劑。

　　4、結語

　　由于HPCE具有高效、快速和樣品用來少等優異的特點，在應用于生命科學的同時，近年迅速擴展到其它領域，包括食品化學、藥物化學、環境化學、毒物學、醫學和法醫學等。用HPCE分離無機離子，可在1.8min內分離陽離子[15]，3min內分離30中陰離子[16]，它在無機離子分離方面無與倫比的能力，使盛行十幾年的離子色譜黯然失色。HPCE分離有機離子、藥物分子，特別是手性和生物大分子方面的能力，也對HPLC地位提出了嚴峻的挑戰。正因為HPCE技術具有如此誘人的優點，使它在短短的十幾年中，特別是在最進幾年，受到分離分析科學家的極大關注，成為生物化學和分析化學中最受矚目，發展最快的一種分離分析技術。

　　參　考　文　獻

　　1、羅國安，王義明.毛細管電泳的原理及應用.色譜，1995;13：254

　　2、魏偉，王義明，羅國安.毛細管電色譜研究進展.分析化學.1997;25(3)：361

　　3、孫曾培.膠束動電色譜法在藥物分析中的應用.藥物分析，1993;13(1)：48

　　4、劉志松，方肇倫.高效毛細管電泳在藥物分析中的應用.色譜，1996;14(5)：364

　　5、牛長群，祝仕清.高效毛細管色譜測定氨芐青霉素聚合物.藥學學報，1997;32(3)：207

　　6、李關賓，范春生，邢存章.3種維生素的毛細管電泳分析.色譜，1997;15(1)：65

　　7、廉經武.美西律對映體的毛細管電泳.分析化學，1997;25(3)：290

　　8、俞琦，王義明，羅國安.氧氟沙星對映體的手性分離.藥學學報，1997;32(3)：203

　　9、張文江，周同慧.HPLC分離海南新堿衍生物HH7OA研究.藥物分析，1997;17(1)：14

　　10、孫發山，王磊，楊迎迎等.高效毛細管區帶電泳直接進樣測定人血漿中頭孢氨芐濃度.色譜，1996;14(2)：132

　　11、劉新宇，候美琴.HPLC法測定復方感冒制劑的研究.藥物分析，1997;17(5)：315