水揚酸比色法測定蛋白質

　　1 原理： 樣品中的pro經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。

　　2 方法 （１）標準曲線的繪制

　　取6個25ml容量瓶編號 0 1 2 3 4 5 6

　　分別加空白酸液 2ml

　　分別加磷酸鹽緩沖液 5ml

　　稀釋至總體體積至15ml

　　分別加水揚酸鈉 5ml

　　37C水浴 15分鐘

　　加入次氯酸鈉 2.5ml

　　37C水浴 15分鐘

　　取出試液于660nm下進行比色，繪標準曲線。

　　（2）樣品處理：

　　準確稱樣0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化劑→電爐上加熱到沸騰后→加大

　　火力消化→直到出現暗綠色時→搖動瓶子→K氏瓶全部消化后→冷卻→加水至250ml容量

　　瓶。

　　（3）樣品測定：

　　準確吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→準確吸2ml→于25ml容量瓶中→加

　　5ml磷酸緩沖液→以下操作與標準曲線繪制的步驟相同

　　并以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標準曲線查出其含氮量。

　　（4）計算

　　 C×F

　　含氮%=    ---× 100

　　 W×1000×1000

　　C---從標準曲線中查出測定樣液的含氮量（Ug）

　　F---樣品溶液的稀釋倍數

　　W---樣品重量（g）

　　pro%=總氮%×K（K可為6.25，也可查）

　　3注意事項：

　　A 當天消化液最好當天測定，結果重現性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。

　　B 當在PH和試劑適當范圍內加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關，應嚴格控制反應溫度。

　　C 這種方法測定結果基本與K氏法一致。

　　4 試劑

　　（1）氯標液：稱經110℃干燥2h的硫酸銨0.4719g→于燒瓶中定容10ml→此液1ml相當于

　　1.0mg氮標液→使用時配制成1ml相當于2.50Ug氮標液。

　　（2）空白酸液：稱0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化劑→與樣品一樣消化→定容250ml→

　　使用時吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。

　　（3）磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉→加38g磷酸三鈉→加20g三九石酸鉀鈉→加400ml水

　　溶解→過濾→另稱35gNaOH溶于100ml水中→冷至室溫→緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中→加

　　入水稀釋至1000ml備用。

　　（4）水揚酸鈉溶液：稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于200ml水中過濾，加水稀釋

　　至500ml

　　（5）次氯酸鈉溶液：吸4ml安替富民液，用水稀釋至100ml

　　 5 儀器

　　（1）分光光度計

　　（2）恒溫水浴