水稻葉片和根蛋白質的納升級二維液相色譜串聯質譜實驗

實驗材料：反相裝填材料     

試劑、試劑盒：

緩沖液                                                                 

HPLC 級乙腈                                                                  

HPLC 級甲醇                                                                 

氯化鈣溶液                                                                  

碳酸氫銨溶液 

儀器、耗材：離子講串聯質譜儀   

實驗步驟：

3.1 葉片和根組織的取材以及蛋白質沉淀

( 1 ) 從植物的中部切取未衰老的綠色葉片，立即放入自封塑料袋中冷凍。如果沒有冷凍設備，可先放在冰上，然后再放到 -20°C 保存。

( 2 ) 挖出植物根系，在綠色莖段以下一英寸的地方取材。抖動根系，并快速的依次放入 3 個大燒杯中洗去土壤，然后再放入自封塑料袋中冷凍，或暫時保存在冰上。

( 3 ) 稱取 2.5 g 去除了莖稈和其他物質的冰凍葉片和根系，用預冷的剪刀剪碎樣品后 ，放入預冷的陶瓷研缽中，加液氮研磨至粉末，需要多次添加液氮，以保持組織的冰凍狀態。

( 4 ) 把冰凍的葉片或根系粉末放入 40 ml 離心管中，加入 25 ml 葉片重懸液，振蕩混合，確保所有的粉末被重懸起來后，在 -20°C 下靜置 45 min，再振蕩搖勻，35000 g 離心 15 min。

( 5 ) 用玻璃移液管吸去上清液，注意不要擾動沉淀。用等體積的 EDTA 洗液洗滌沉淀。振蕩打散沉淀，冰上靜置 5 min，35000 g 離心 15 min。重復操作至少兩次，直到葉片蛋白質沉淀不再有綠色。

( 6 ) 冰凍干燥沉淀物，得到含有蛋白質、細胞壁和纖維的淡褐色材料。

3.2 從三氯乙酸/丙酮沉淀的粉末中制備蛋白質樣品

( 1 ) 針對每個樣品，分別稱取 20 mg 的三氯乙酸/丙酮沉淀粉末（制備方法見 21.3.1 ) 放入有蓋的 1.5 ml 離心管中。

( 2 ) 在每只管中加入 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl  ( pH 8.5 ) ，渦旋振蕩 1 min，18000 g 離心 10 min，棄上清液（見注釋 1)。

( 3 ) 在每只管中加入 500 μl 的 8 mol/L 尿素，渦旋振蕩 5 min，超聲波水浴處理 10 min，然后旋轉振蕩 30 min。

( 4 ) 18000 g 離心 10 min，將約 400 μl，含蛋白質濃度為 0.1~0.5 μg/μl ( 見注釋 2 ) 的上清液移至另一只管中。

( 5 ) 用 8 mol/L 尿素重復第 3 和第 4 步驟，合并上清液，調整容積到 600 μl。

3.3 抽提蛋白質的蛋白酶消化

( 1 ) 在總容積為 600 μl 的蛋白抽提液中添加 5 μl 外切賴氨酸蛋白酶工作液，在旋轉振蕩器上 37°C 消化過夜（見注釋 3) 。

( 2 ) 在每個樣品中分別加入 2300 μl 的 100 mmol/L 碳酸氫銨，30 μl 的 100 mmol/L 氯化鈣，60 μl 的乙腈，10 μl 的胰蛋白酶工作液。終濃度為：1.6 mol/L 尿素，76 mmol/L 碳酸氫銨，1 mmol/L 氯化鈣，2% ( V/V ) 乙腈，3.3 ng/L 胰蛋白酶。

( 3 ) 在旋轉振蕩器上 37°C 消化 24~48 h。添加 60 μl 甲酸使終濃度為 2%，將樣品保存在 -20℃ 備用。

( 4 ) 用 15 ml 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 SeP- Pak 層析柱，然后用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水清洗柱子 4 次。

( 5 ) 吸取 3 ml 蛋白酶消化液加樣到已平衡好的 C18 Sep-Pak 層析柱上，收集流出的液體，再重復慢速過柱兩次。用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水洗柱子，洗脫鹽及其他松散結合物質。再用 3 ml 含有 0.1% 的甲酸的 90% 乙腈溶液將肽段從 C18  Sep-Pak 柱上洗脫下來。

( 6 ) 用真空干燥濃縮機將上述洗脫液濃縮到約 500 μl。16000 r/min 離心 10 min，如果還有沉淀，取上清液，去沉淀。繼續用真空干燥濃縮機濃縮樣品到 50 μl，用含有 0.1% 甲酸的雙蒸水稀釋到 200 μl。

( 7 ) 用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 Spec- Plus 固相萃取移液器吸頭，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水沖洗 5 次。

( 8 ) 吸取 200 μl 肽段溶液加樣到已平衡好的 C18 Spec-Plus 固相萃取移液器吸頭上，收集流出的液體，再重復慢速過柱兩次（見注釋 4) 。用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水沖洗柱子 5 次，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液將肽段洗出。

( 9 ) 用真空干燥濃縮機將上述洗脫液濃縮到約 10 μl，此溶液可直接上樣到雙相 Mudpit 層析柱。

3.4 制備帶噴霧發射器的二維（SCX/RP) 納升級高效液相色譜層析柱

( 1 ) 層析柱的制備：將一根長 25 cm，內徑為 100 μm，外徑為 360 μm 熔融石英毛細管推入一個激光拉制儀中，留一截 3~8 μm 的熔融石英毛細管頭部。這樣它既可以用作離子源針頭，也可用作連接到質譜儀進樣口的層析柱 [ 25 ]。

( 2 ) 將裝有懸浮在甲醇溶液里填充材料的微型離心管放入壓力室中，并蓋好蓋。將毛細管的鈍頭用金屬箍與上蓋擰緊相連，深度與填充物質一致，擰緊金屬箍后，氣室加壓到 500 psi，將懸浮在甲醇溶液中的填充材料推入到層析柱中，當填充材料被裝填到毛細管的 3~8 μm 的尖頭時，甲醇通過柱子流向其頂部，在毛細管中先裝入 4 cm 強陽離子交換（SCX ) 填充物，然后再裝入 8 cm 反相層析（C-18 ) 填充物。

( 3 ) 用 PEEK T 形管連接器將填充好的柱子與高效液相色譜（HPLC) 連接，這個 T 形管連接器的金線電極（與質譜儀的高壓電源相連）為層析柱上游提供電壓，與柱子的洗脫溶液形成液相連接。

( 4 ) 用 HPLC 緩沖液 B 洗層析柱 1 h，流速為 1 μl/min，使柱體填充物完全填實。

( 5 ) 在使用前，用 HPLC 緩沖液 A 平衡柱子 1h，流速為 1 μ/min。

3.5 二維納升級高效液相色譜分離肽段

柱切換分離是一種在線分離方法，通過 HPLC 緩沖液連續洗脫雙相柱，使洗脫液進入質譜儀，以確保在上樣、鹽洗脫和沖洗柱的過程中不丟失樣品。第一相根據電荷性質分離肽段，第二相是根據疏水特性分離肽段。

( 1 ) 將 10 μl 樣品注入 10 μl 自動進樣環中，完成將肽段加載到強陽離子（SCX ) 柱床上（見注釋 5) 。

a. 用 5% 緩沖液 B 以 10 μl/min 的流速注入進樣環，將肽段推入自動進樣環中，這個過程大約需要 25 min。

b. 然后將液流速度降至 400 nl/min，注入 35 min，將樣品全部推入，并沖洗柱子。

c. 通過陽離子交換介質的任何肽段將結合到反相介質上，任何通過這兩個樹脂介質的肽段都將在質譜儀中被檢測和破碎，全部的運行時間大約需要 70 min。

( 2 ) 用 5%~50% 的緩沖液 B 以 400 nl/min 的速度反相梯度洗脫 60 min。然后再用 50%~98% 的緩沖液 B 梯度洗脫 5 min，并用 98% 的緩沖液 B 洗脫 5 min，這樣，殘留的肽段都將被洗脫下來。用 5% 緩沖液 B 快速（ 1 min ) 沖洗柱子，然后增加沖洗流速到 1 μl/min 沖洗柱子 24 min，重新平衡柱子，全部運行時間為 95 min ( 見注釋 6) 。

( 3 ) 用 250 mmol/L 乙酸銨溶液逐步增加濃度洗脫 SCX 柱子 4 min，每次鹽洗脫后都要伴隨著反相梯度洗脫（ 見步驟 2 中描述的），使離子交換介質中的多肽轉移到反相介質中。那些松散結合在柱子上的肽段可在低濃度的緩沖液 C 中被轉移，而結合緊密的肽段則需要更高濃度的緩沖液 C 或緩沖液 D。

a. 首先用 5% 的緩沖液 B 洗脫 5 min，流速為 400 μl/min。

b. 用 X% 的緩沖液 C 洗脫柱子 4 min，第一次鹽洗脫中，X = 10%。

c. 用 5% 的緩沖液 B 洗脫柱子 7 min，然后用 5%~50% 緩沖液 B 的反相梯度洗脫  60 min。

d. 用 50%~98% 緩沖液 B 梯度洗脫柱子 5 min，再用 98% 緩沖液 B 洗脫 4 min 后，殘留的肽段將被洗脫下來。

e. 用 5% 緩沖液 B 快速沖洗柱子，然后，增加到 1 μl/min 的流速持續沖洗 24 min，重新平衡柱子。

f. 之后用不同百分濃度（X = 20、30、40、50、60、70、80、90、100 ) 的緩沖液 C 分步洗脫柱子，每 10 步洗脫時間為 105 min。

( 4 ) 當 250 mmol/L 乙酸銨溶液鹽洗脫結束后，最后一步鹽洗脫是用 50% 的緩沖液 D 代替前面提及的 X% 緩沖液 C，以確保將所有緊密結合在 SCX 柱上的肽段轉移到反相介質上。快速梯度變化洗脫以及用 98% 緩沖液 B 洗脫 20 min 可最大限度地將緊密結合在反相介質上的肽段洗脫下來。全部的運行時間為 105 min。表 21-1顯示了步驟 3 和步驟 4 的層析過程。

3.6 運用 Thermo  Electron 公司的高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀 LCQ   DecaXP  Plus 進行數據依賴性串聯質譜分析

( 1 ) 儀器基本參數：質譜檢測掃描范圍：m/z 400~1500；5 次顯微掃描，進樣時間：500 ms，質譜信號靈敏度：1 X 10⁵；裂解分離選擇寬度：2.7 Da；肽段的默認攜帶電荷值：MS/MS=2； 噴霧電壓：1.8 kV；動態排除： 7 min 窗口，重復計數= 2 , 記錄時間=0.5 min；排除質量：低值 = 0.8 amu，峰值 = 1.5 amu；碰撞能量歸一化 = 35%，激發 Q 值= 0.25，碰撞時間=30 ms；選擇 3 個最強的離子按照 n= 3、2、1 的順序用于裂解。

( 2 ) 使用這些參數設置，當程序設定讀取從層析柱上洗脫下來的肽段的串聯質譜信號 ，質譜儀就會連續不斷地獲得前面所述的 HPLC 中貫穿 13 個步驟的數據。動態排斥是為了確保肽段的豐度，以及與其相關的同位素沒有被重復裂解，從而最大限度地分散選擇裂解的不同肽段離子。

3.7 利用數據檢索鑒定蛋白質

將無法閱讀的串聯質譜圖譜在蛋白質序列數據庫上檢索比對，用以鑒定經蛋白酶消化后的肽段，用這些肽段的鑒定信息組裝成蛋白質鑒定信息。

( 1 ) 用下列軟件程序之一，將全套串聯質譜在適當的蛋白質序列數據庫中進行檢索：

Sequest  (Themo Hectron 公司） [26，27]， Mascot (Matrix   Sciences公司，London，UK )  [ 28，29] 或Xtandem  ( 開放軟件，可從馬尼托巴蛋白質組學中心獲取 http :  " www.   proteom& ca/opensource,   html) 。



( 2 ) 在大多數生物樣品的制備過程中存在許多的內源蛋白酶，所以在消化過程中也會出現非胰蛋白酶消化肽段。因此，最好在搜庫設置參數時，不要特別指出全胰蛋白酶解肽段，這樣可以避免明顯的信息丟失。

( 3 ) 肽段鑒定數據需要排序和篩選，去除盡可能多的無關信息。遺憾的是，沒有一種明確設定的標準能夠保證從數據檢索程序中輸出的所有肽段是正確的，也無法排除不正確的肽段。一篇闡述數據檢索參數的綜述文章將告訴人們，在這個問題上幾乎沒有統一的意見。最好的辦法是，在相同的實驗室，使用相同的儀器設備，用已知的蛋白質消化樣品，優化和改進一套公布的參數。肽段判斷的準確性也可以通過搜索統計顯著性評估 [ 32，33] 或通過重復檢索一個反相蛋白序列數據庫 [31，34，35 ] 來得以改善。

( 4 ) 一個仍存在爭議的問題是， Mudpit 數據報告是否列入基于單一肽段鑒定的蛋白鑒定。一般情況下 Mudpit 實驗中大約有一半的蛋白質鑒定是根據單一肽段信息鑒定出來的，所以這是一個很重要的需要考慮的問題。當然，一些蛋白質鑒定是非常準確的，因為一個小的蛋白質可能只有一個可用的胰蛋白酶水解肽段，或者一些修飾遮蔽了其他肽段的鑒定，或者雖然有許多胰蛋白酶水解的肽段產生，但是只有一個被正確地選擇去裂解。此外，以單一肽段為基礎的蛋白質鑒定可以在大多數 Mudpit 數據庫中獲得。數據庫檢索參數的微小變化會嚴重地影響搜索結果，產生假陽性鑒定的幾率很高。蛋白質鑒定最好要報告基于兩個或更多個肽段鑒定信息的蛋白質數量，以及兩個不同的圖譜包含單個肽段鑒定的數量 [36] ( 見 21.3.8) 。

3.8 結果舉例：從成熟水稻中制備的葉片和根系組織的 Mudpit 分析

1. 植物的生長和收集水稻（Oryzasahm，cv.  Nipponbare) 種子種在溫室中，每天光照 12 h，控制 12 h 光照溫度為 29°C，12 h 黑暗溫度為 21°C，維持 30% 濕度，植物生長在含有 50% Sim-shine 混合土和 50% 硝基腐殖質土的小盆中，萌發 50 天后取葉片和根材料。

2. 蛋白質抽提、樣品制備和 Mudpit 分析

用研缽將葉片和根在液氮中研磨成粉末。用 TCA/丙酮法抽提蛋白質（方法見 21. 3.1)，用 3.2 和 3.3 的方法消化抽提得到的蛋白質，肽段混合物按照 3.4~3.7 中描述的方法進行分析。

3. 質譜數據庫檢索與分析

所有串聯質譜數據比對搜索 NCBI 的公共資源中的一個水稻蛋白序列數據庫，同時輔以一個包括胰蛋白酶、胞內蛋白酶賴氨酸-C、角蛋白、白蛋白、酪蛋白及其他普通實驗室污染物的內在污染物文件。

用 Xtandem 軟件檢索數據，并用蛋白質組學全球分析機器網絡工具（www.thegpmorg) 來分析數據。Xtandem軟件檢索參數的設置：碎片離子單一同位素質量誤差：0.5 Da；母離子單一同位素質量誤差：2.0士Da；頻譜動態范圍：100；頻譜總峰：50；最大有效閾值 >0.1。氧化作用引起的 16 Da 的甲硫氨酸可變修飾是可以接受的。

4. 用 Mudpit 分析水稻葉片和根的實驗結果表 21-2~ 表 21-4 顯示了 Mudpit 分析水稻葉片和根的實驗結果。每個實驗鑒定出來的蛋白總數列在表 21-2中；分為 3 類：兩個或更多個鑒定肽段；兩個或更多個鑒定肽段或為一個預值小于 0.001 的鑒定肽段；預值小于 0.1 單個或多個鑒定肽段。這些鑒定蛋白質數量又被分為根和葉共有的，以及它們各自特有的幾類。表 21-2 還包括了每個實驗中檢索到的 MS/MS 頻譜數量的信息，以及上文描述的在每個分類項中肽段的數目。





這些實驗結果清楚地說明了以下幾點。

( 1 ) 在一次實驗中，可以從一種植物組織材料中鑒定出數百個蛋白質。

( 2 ) 檢索從兩個實驗中獲得的所有超過 91000 MS/MS 的頻譜，運用最低標準，我們在葉片中鑒定出 578 個蛋白質，根中鑒定出 538 個，其中包括 1005 個非冗余蛋白質鑒定。

( 3 ) 運用兩個或多個鑒定肽段的更嚴格的標準后，這些數字分別縮減到 329、303 和 549。

( 4 ) 基于一個鑒定肽段的蛋白鑒定數量占總數的 43%，這與之前公布的數據集相符 （或略低于），這些數據集中百分數已被特別報道 [ 12，36，38] 。從這兩個實驗中鑒定出來的蛋白質數量是非常一致的，特別是當不把重復性在 Mudpit 分析技術作為重點考慮 Mudpi，但是，鑒定出來的非冗余蛋白質總數顯示，在兩個數據集中僅有 10% ~15% 的交疊，這正好說明蛋白質表達的組織特異性。

這些結果中另一個有趣的特征是，雖然在葉和根中鑒定出的蛋白質數量相似，但在葉片中鑒定到的肽段是根中的兩倍以上。這是由于從葉片中鑒定出的大量肽段來自 RuBisCo 造成的，如表 21-3 所示。

表 21-3 列出通過 Mudpit 分析，從水稻葉片中鑒定到的前 25 個蛋白質，根據 Xtandem 蛋白質預值排序。表  21-4 列出通過 Mudpit 分析，從水稻根中鑒定到的前 25 個蛋白質，也是按照 Xtande 蛋白質預值排序。表 21-3和 表 21-4 中列出了在葉和根組織中含量最大的蛋白質，這些蛋白也是這些組織中主要的蛋白質，而且表達量很高 。葉片組織中存在許多 RuBisCo、ATP 合成酶、光系統蛋白復合物以及其他幾種葉綠體特異蛋白的異構體。根中含有大量碳水化合物代謝酶，如蔗糖- UDP 葡糖基轉移酶 2，磷酸丙糖異構酶，抗壞血酸過氧化物酶和三磷酸甘油醛脫氫酶。有趣的是：根中也包含一些可能在對土壤中生物和非生物脅迫響應機制中發揮重要作用的高水平表達病程相關蛋白。