水稻總DNA的快速少量抽提CTAB法

DNA分子是分子生物學研究的基本材料，依不同的實驗目的可采取不同的抽提方法獲取數量和質量不等的 DNA 。

實驗目的：了解植物  DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。

實驗材料及試劑： 水稻  葉片，1.5 × CTAB ，氯仿 / 異戊醇 (24:1) ，95% 乙醇或無水乙醇等

實驗原理：植物 DNA 的抽提常采用兩種方法：

(1)SDS 法： 離子去污劑，過程長，純度高;

(2)CTAB 法：該方法簡便、快速，DNA 產量高 ( 純度稍次，適用于一般分子生物學操作 ) 。CTAB 是一種非離子去污劑，植物材料在 CTAB 的處理下，結合 65℃ 水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA 被釋放出來 。CTAB 與核酸形成復合物，此復合物在高鹽 (>0.7mM ) 濃度下可溶，并穩定存在，但在低鹽濃度 ( 0.1-0.5mM NaCl )下CTAB- 核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。經離心棄上清后，CTAB- 核酸復合物再用 70 - 75% 酒精浸泡可洗脫掉 CTAB 。再經過氯仿 / 異戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化 DNA ，最后經異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。

實驗步驟：

1.采集適量幼嫩葉片，用液 N2 研成粉末，0.4 g 裝入 1.5ml 離心管中( -20 ℃預冷)。

2.預熱 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中，混勻(防止凍融)。

3.立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下顛倒 1 次。

4.12000g 離心 5 min。

5.吸取上清液約 600μl ，加入等體積( 600μl )氯仿 / 異戊醇 (24:1) ，上下顛倒數次，至下層液相呈深綠色為止。

6.12000g 離心 5 分鐘。

7.取 450μl 上清于一新 1.5ml 離心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ，混勻，室溫放置 10min 。

8.12000 g 離心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥約 30 min 。

9.加入 50μl 1/10 TE 或無菌水(含 20μg/RNase )，置于 4 ℃過夜，待 DNA 溶解后，檢測 DNA 濃度及質量。

注意事項：

1.盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質多，必須用 10 mM 的β -ME 處理。

2.研缽預凍，粉末至加 CTAB 前不要融化。

3.24:1 的氯仿 / 異戊醇抽提時動作應輕柔，轉移用的槍頭最好是剪寬了的。

4.所用試劑必需滅菌，手套。