活體動物體內成像系統使用方法(以IVIS100系統為例)

　　體內可見光成像相對于其它的成像方法，成像過程簡單，快速。

　　1，配制底物熒光素溶液和注射實驗動物：

　　1）材料：D-熒光素（sciencelight luc001）

　　DPBS, W/O Mg2+, Ca2+

　　0.2um 針頭濾器

　　注射器

　　2）新鮮配制15mg/ml熒光素DPBS溶液，過0.2um除菌濾器。

　　3）注射實驗動物，用量為10 μl/g 體重，即150mg熒光素/kg體重。例如，對于10g體重小鼠，注射100ul，即1.5mg熒光素。

　　4）腹腔注射后10-15分鐘后用成像系統觀察。

　　注意事項：

　　熒光素溶液可先配制成200倍濃縮液置于-20℃保存，使用前稀釋到15mg/ml。

　　對同一只小鼠來說，注射不同量的熒光素，發光強度不同，隨著熒光素注射量的增多，發光增強。

　　一般來說，熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達熒光酶的細胞開始發光, 十分鐘后強度達到最高。 在最高點持續約20-30 分鐘后開始衰落, 約三小時后熒光素排除, 發光全部消失，所以最好的檢測時間是在注射后15到25分鐘之間.但需要注意的是，對于不同的動物模型，發光動力學過程并不完全一致，最好先進行預實驗確定何時發光信號最強。

　　熒光素注射位置最好選在左下腹部，對于非刺激性溶液，小鼠可很好地耐受1ml。

　　2，麻醉實驗動物

　　可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實驗動物。對于采用異氟烷麻醉動物，方法如下：

　　1) 稱量異氟烷吸收過濾器的重量，看是否必要更換過濾器。當過濾器過重時，吸附物過多，應及時更換；

　　2）確保氧氣供應已切斷，將蒸發器面板調至“OFF”位置，向蒸發器腔內注入異氟烷，不要超過最大刻度指示線；。

　　3）打開氧氣罐閥門，保證壓力為55psi左右；

　　4) 將氧氣流速調為1L/min；

　　5）將動物放入麻醉倉，蓋好蓋子；

　　6) 打開麻醉倉管道閥門（確保麻醉多支管閥門處于關閉狀態）；

　　7）將蒸發器面板刻度調到3％（動物在1-2分鐘后就會被麻醉）；

　　8）當動物對輕晃麻醉倉無反應時，將蒸發器面板刻度調到1.5-2％；

　　9）將麻醉多支管閥門打開。

　　10）迅速打開麻醉倉，取出實驗動物，將圓錐吸入器套上。

　　11）關閉麻醉倉管道閥門。

　　12）開始進行成像操作或接種細胞。

　　注意事項：

　　一旦停止麻醉氣體供應，動物會在幾分鐘內蘇醒。

　　本麻醉系統僅適用異氟烷麻醉，使用其它麻醉劑可能會導致危險。

　　在處理剩余的麻醉劑時實驗室要具備良好的通風條件，建議遵照已公布的安全條例進行操作。

　　XGI麻醉系統要始終保持直立狀態。

　　當成像或接種細胞結束后，關閉氧氣閥和麻醉多支管裝置閥門。

　　克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉方法：

　　1）將克他命（100mg/ml）和甲苯噻嗪（20mg/ml）按體積比4：1混合。

　　2）采用肌肉注射方式，克他命和甲苯噻嗪的劑量分別為120mg/kg體重和6mg/kg體重，即每克體重注射1.5ul。

　　3）麻醉劑一般在注射后2-3分鐘起作用，如有必要，可再注射一次，用量為每克體重注射0.7ul。

　　注意事項

　　注射一次麻醉劑，動物的蘇醒時間大約在60-90分鐘之間，多次注射則蘇醒時間會更長（4小時以上）。

　　多次注射可能會使動物過度麻醉。

　　3，成像系統使用

　　（1）系統啟動：打開電腦主機和監視器；打開IVIS成像系統；當電腦顯示桌面后，打開活體成像軟件；按照提示輸入用戶ID（最多三個字面），然后點擊“Done”；點擊鏡頭控制面板的“Initialize”按鈕初始化系統；等待系統進行初始化，可以聽到馬達運轉的聲音和看到系統狀態顯示發生變化；等待鏡頭達到它的工作溫度，（參看“工作溫度”）直到鏡頭控制面板上綠燈亮；此時鏡頭溫度被鎖定在工作溫度-105℃，可以進行操作了

　　（2）在成像暗箱門下方是平臺加熱控制按鈕，停止按鈕，手動光照控制按鈕和鏡頭狀態指示燈。具體操作如下：

　　平臺溫度控制器：改變平臺的溫度，并且可以顯示平臺攝氏溫度或華氏溫度。平臺溫度預設為37℃，按下“set”按鈕可以看到平臺的實時溫度，持續按住“set”按鈕的同時按上下按鈕可以改變平臺溫度，注意：如果改變的幅度過大，平臺可能最多需要45分鐘的加熱時間。

　　停止按鈕：可以立刻停止成像暗箱內部所有四個馬達的運轉。

　　注意事項：

　　只有當發生嚴重故障時這個按鈕才可以被按下，如當平臺上升過程中，承載的樣品過高可能會損壞成像暗箱時。按下停止按鈕后，如需重新啟動系統，請按照程序啟動系統并進行初始化。切斷IVIS系統的電源，等待5秒，重新接通電源，點擊鏡頭控制面板上的初始化按鈕，完成初始化程序后就可以進行成像操作了。

　　光照強度控制旋鈕：使用此旋鈕可以改變成像暗箱內部LED的光照強度，這個LED是用來照亮樣品用的。LED的開關是成像軟件的鏡頭控制面板的“Light On”按鈕。通過旋轉按鈕調整需要的光照強度，旋鈕分十階并有鈴聲提示，當達到所需的光照級別，取消勾選鏡頭控制面板的“Light On”可以關掉LED。

　　狀態指示燈：指示是否可以打開成像暗箱門，只有當綠燈亮時才可以打開。一定不要在紅燈亮時打開暗箱門。

　　（3）氣體麻醉：IVIS系統包含一個麻醉氣體控制裝置，在成像暗箱的后面有兩個0.25英寸的進氣和出氣口，暗箱的右邊是控制開關，暗箱內也有兩個0.25英寸的出氣和進氣口分別位于樣品臺的左后和右后方。

　　注意事項：

　　請仔細確認暗箱內的管道或其它固定裝置不會發出熒光，使用者在進行成像操作前請測試這些管道和裝置。

　　（4）暗箱門的操作：IVIS成像暗箱只需使用很輕的力即可牢固鎖住箱門。請定期檢查箱門的鎖緊系統是否工作正常。連接IVIS成像系統成像暗箱平臺的擋簾可以遮蓋住平臺下部的空間，這個擋簾提醒使用者不要在平臺下放任何物品。

　　（5）成像前基本準備

　　黑色墊紙：盡管平臺是經過黑色電鍍處理的，但還是建議使用者在成像時在平臺上墊一張高品質的黑色墊紙，特別當是生物樣本時。高品質黑色墊紙可以有效的阻止光反射，并且可以保持平臺清潔。

　　將成像物品置中：將樣品放置在成像平臺正中，關上暗箱門，勾選鏡頭控制面板上的“Live”按鈕，監視器上將顯示樣品的圖像。如果樣品已經置中，取消勾選“Live”按鈕后就可以進行成像操作了，如果偏離中心，點擊“Live”按鈕后，打開箱門，調整樣品的位置，重復上述步驟直到在監視器上看到樣品圖像。

　　發光材料：使用者請牢記“任何物體都會發熒光”，大部分塑料，幾乎所有的磁帶，植物，染料，吃的食物（大部分是植物），鼠尿，動物窩里的草墊都已經被證實可以發熒光，采用熒光成像時應盡量避免這些物質的污染。使用者操作IVIS成像系統時應戴上手套。

　　（6）系統關閉程序

　　不建議在一天內多次開關系統，每天凌晨，通常是早上4點到6點，IVIS系統會自動進行背景測量和系統自檢。如果必須關閉系統，一定要嚴格按照以下步驟進行。

　　a, 保存實驗結果，關閉活體成像軟件。

　　b, 關閉IVIS成像暗箱。

　　c, 關閉Windows操作系統。