活體成像——讓腫瘤細胞無處遁形

在科普今天的知識前，不禁讓小編回憶起大學校園的美好時光，那個時候小編還是個走在綠樹蔭下的青澀少年啊，在一次參加關于腫瘤免疫學的學術會議上，看到了類似下面這種圖，我就在想，這小鼠是修煉了什么內家功法，被打通任督二脈了？那五顏六色的東東是什么？經過向老師還有身邊的小伙伴們請教才知道，這是利用活體成像技術做到的哇！當時覺著這東西好高大上啊，小編真是孤落寡聞了，實在慚愧！小編后來對這個技術進行了一番考究，下面就給大家說道說道。

圖1.活體成像^[1]

早在1999年由美國哈佛大學Weissleder博士（圖2）率先提出了分子影像學(molecular imaging，MI)的概念，即應用影像學的方法對活體狀態下的生物過程進行細胞和分子水平的定性和定量研究。活體成像便是基于分子影像學孕育而生的，通過這個成像系統，可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移，感染性疾病的發展進程，特定基因的表達等生物學過程。

近年來，我國醫療健康產業發展突飛猛進，新藥研發逐漸成為科研機構和醫藥公司重點研究領域，其中活體成像為藥物研發貢獻了一份十分寶貴的力量。目前，小動物活體成像技術應用到藥物研發的實驗方法主要有生物發光和熒光兩種。

基于生物發光的活體成像技術方法與應用

生物發光主要是應用熒光素酶（Luciferase）對基因、細胞和活體動物進行標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶的基因插入到預期觀察的細胞染色體內，通過對克隆細胞進行篩選，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株。再將細胞株轉移至特定的小鼠體內形成模型。向模式小鼠注射一次熒光素（熒光素酶的底物）能保持其體內熒光素酶標記的細胞發光持續30-45分鐘。因為每次熒光素酶催化反應只能產生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，因此需要先進的成像系統，再應用一個高度靈敏的制冷CCD相機以及特別設計的成像暗箱和成像軟件，才可

簡單來說，熒光素酶與底物反應后，會產生化學發光。這種光是由化學反應而來，不需要激發光。儀器記錄的是單位時間內檢測到的光子數，也就相當于直接定量的記錄了表達熒光素酶的細胞數量。

圖3. 應用制冷CCD相機捕捉光源

下面隨小編一起來看一組活體成像技術在多發性骨髓瘤血液系統疾病上的應用示例：Myc 基因是細胞增殖的主要調節因子，而且對于癌癥腫瘤細胞分裂，新陳代謝和存活都有重要作用。JQ1是用來抑制BET溴區結構域的小分子，而且可以下調Myc基因轉錄水平。將JQ1腹腔注射到荷多發性骨髓瘤（經Luciferase標記）小鼠中，活體成像系統顯示JQ1可以抑制骨髓腫瘤細胞生長且提高腫瘤小鼠的存活率（圖3A-B）。結果說明應用JQ1 能夠緩解骨髓瘤癌癥癥狀(腫瘤發展與熒光強度線性相關)。^[5] 

圖4.小鼠靜脈注射Luciferase標記多發性骨髓瘤的活體成像圖^[5]

基于熒光的活體成像技術方法與應用

與生物發光不同，熒光技術是采用熒光報告基因 (GFP、RFP等) 或熒光染料（包括熒光量子點等新型納米標記材料）進行標記，利用報告基因、熒光蛋白質或染料產生的熒光，就可以形成體內的生物光源。生物發光是動物體內的自發熒光，不需要激發光源，而熒光則需要外界激發光源的激發，才可以被成像系統檢測到。熒光標記很廣泛，可以是動物、細胞、微生物，也可以是抗體、藥物、納米材料等^[1,3,4]。

接下來小編帶大家再看一組應用熒光技術的實驗：為研究模式蛋白的腫瘤靶向性，將一種近紅外熒光分子吲哚菁綠（ICG）包載PDPA（人血清白蛋白表面定點原位生長出具有pH響應性的高分子鏈）制成納米熒光探針（HDI），ICG包載在膠束核內而發生熒光聚集淬滅，但到達腫瘤時，由于腫瘤微環境的弱酸性，膠束解體，ICG釋放出來而恢復熒光，同時由于PDPA質子化帶正電，有利于其吸附在細胞表面以及細胞內吞，從而實現腫瘤靶向熒光成像。本項研究也表明，在蛋白表面引入pH響應性高分子鏈可提高蛋白靶向性，藥用蛋白可采用此項技術提高藥效且降低副作用，同時該響應性蛋白質-高分子偶聯物自組裝體系也可作為小分子藥物載體，從而拓展了蛋白藥物和小分子藥物的臨床應用^[6]。（圖5）

圖5. 小鼠靜脈注射HDI納米熒光探針后C8161黑色素瘤在體內和體外熒光成像圖^[6]

雖然熒光信號遠遠強于生物發光，但非特異性熒光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發光。兩者具體優缺點詳見表（一），對于不同的研究，可根據二者的特點以及實驗需求，選擇合適的方法哦^[7]。 

表（一）

 

當然，除了上述兩個方法外，也有通過Luciferase標記腫瘤，再用熒光探針標記抗體進行研究的。如圖6所示，應用BLT（生物發光成像）對穩定表達Luciferase的小鼠乳腺腫瘤4T1進行定位（圖6A），再對小鼠尾靜脈注射熒光探針（IRDye800CW）標記的PD-1抗體，經FMI（熒光成像）檢測PD-1-IRDye800CW生物分布（圖6B）。^[8] 通過這種方式，我們可以一邊觀察腫瘤細胞在哪里，一方面觀察抗體藥分布情況，看上去就更高端了，有沒有？

圖6. FMI檢測荷4T1-Luc乳腺腫瘤小鼠的PD-1-IRDye800CW生物分布^[8]

重點來啦，百奧賽圖目前擁有自主開發的B-IL17-EGFP敲入小鼠，該小鼠模型所有表達IL17的組織細胞同時表達綠色熒光蛋白(EGFP)，用以研究與細胞因子IL-17相關的一系列慢性疾病^[9]。藥理藥效平臺擁有多種GFP-Luciferase細胞系及腫瘤模型，可以進行皮下及原位腫瘤模型建立或轉移瘤模型建立，開展針對相應模型的體內藥理藥效服務^[10]。基因編輯平臺可根據客戶需求提供多種報告基因（如EGFP、mRFP、mCherry、mYFP或LacZ等）小鼠(目的基因的位置引入報告基因)，方便研究目的基因啟動子的轉錄活性，監控目的蛋白表達定位及細胞運轉等^[11]。如有需要，歡迎小伙伴們詳細咨詢哦！

 

參考文獻

[1] Stout D, David J. Optical Bioluminescence Protocol for Imaging Mice. Methods Mol Biol. 2018;1790:29-40.

[2] https://en.wikipedia.org/wiki/Ralph_Weissleder

[3]王紅建，熊曉鵬，戴云海等。活體生物發光成像技術及其在消化道研究領域中的應用. 胃腸病學和肝病學雜志。2010

[4]李冬梅，萬春麗，李繼承。小動物活體成像技術研究進展.中國生物醫學工程學報。2009

[5] Delmore JE,et al. BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell. 2011 Sep 16;146(6):904-17.

[6]LiP, SunM, XuZ, LiuX, ZhaoW, GaoW.Site-Selective in Situ Growth-Induced Self-Assembly of Protein-Polymer Conjugates into pH-Responsive Micelles for TumorMicroenvironment Triggered Fluorescence Imaging. Biomacromolecules. 2018 Nov 12;19(11):4472-4479.

[7]https://baike.baidu.com/item/可見光活體成像技術

[8]Yang Du,et al. Improved resection and prolonged overall survival with PD-1-IRDye800CW fluorescence probe-guided surgery and PD-1 adjuvant immunotherapy in 4T1 mouse model.Int J Nanomedicine. 2017; 12: 8337–8351.

[9]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/103.html

[10]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/13.html

[11]http://www.bbctg.com.cn/index/index/geneinfo/id/46/cateid/65/cid/12.html