液相色譜儀分離純化煙草疫霉菌激發子

采用陰離子交換層析和疏水相互作用層析從煙草疫霉菌培養基中分離出一種新的90和激發蛋白，討論了陰離子交換色譜流動相的最佳值，建立了疏水作用色譜、硫酸銨和羥甲基氨基甲酸酯的水洗脫方式，簡化了純化步驟，降低了活性損失的風險。

1。引言1988等1。首次從疫霉病菌培養基中分離出分子量為種子印記的蛋白質，命名為誘導子。由于該菌對棉花類寄主植物能造成毀滅性病害，因此對疫霉菌激發子霉病等多種重要植物病原物的系統廣譜抗性，誘導植株產生廣譜抗病性，使得它具備了作為新型生物農藥的條件，所以植物病理學家直在努力分離提取和研究激發子蛋白2本文從煙草疫霉菌，此0〃31.在新00,0培養基中，采用陰離子交換色譜法和準多維色譜法分離純化了一種新的90乳誘導子，國內外尚無報道。了解植物抗疫霉病的分子機理，設計植物抗疫霉病基因工程，開發新的生物農藥，具有重要的理論和實踐價值。

2.1試劑和儀器，蛋白快速高效液相色譜儀，試劑566是陰離子交換色譜填料；366類；紙疏水色譜填料；例如，3、咖啡6、預填充柱、81 S公司；輕甲基脲，3、0-Out公司。

2.2提取粗蛋白4，離心2，加入硫酸銨至7，4，靜置過夜。12離心5芯沉淀，2，0，3。

6.0暫停。懸浮液在10000和3環己烷后離心分離。

2.3色譜儀條件2.3.1陰離子交換柱3邦150216。；流動相入。20兒6.0，8.Man+1后1二氯化鈉；流速2.5、30，梯度洗脫介質虛線。

用疏水層析法提取活性峰組分，進行進一步純化。

2.3.2疏水作用色譜柱56，8扭書6阻。；流動相人。0.8mL硫酸銨20mmoyLTis.HClpH6.0；B.MiniQ水；流速l，5myL.梯度洗脫中虛線所，2.4活性和純度測定將1001激發子呀3溶液注入盆栽煙草葉片，24之后即可看到壞死性斑點。用十碳酰鈉橫向電泳505測定蛋白質純度。

3結果和討論3.1陰離子交換色譜1的選擇蛋白質的陰離子交換色譜，流動相的，1值是十分重要的參數，經過比較選擇流動相的口1定為，16013.當，為70，時，雜質峰2干擾活性峰對后面進步的純化帶來了困難；當流動相的PH為5，0lC時，活性峰的得率僅為流動相pH6.0時的50.

3.2疏水色譜填料的選擇3疏水色譜填料包括兩種新型填料：基于聚苯乙烯和瓊脂糖的源系列86、3、6系列其他填料。然而，配體是苯基epharose phehp和資源13。預包裝的短柱填料顯示出完全不同的色譜特性，從21可以看出。當激子峰1不能與雜質分離時，可能是激子蛋白不僅與配體相互作用，而且在穿過疏水柱時參與色譜儀過程。

3.3疏水色譜條件的選擇本實驗的高效液相色譜儀過程主要包括色譜過程、液相色譜過程和反相色譜過程。在“497”液相色譜法分離純化煙草疫霉激子的過程開始時，流動相為203加0.8，1亞硫酸氫銨，以促進目標蛋白與填料之間的疏水作用。這是一個疏水相互作用的色譜過程。然后用純水860，38，nbsp洗脫目標蛋白，它是一種以苯基為種子配體的填充物，非極性，流動相為強極性水，因此第一相實際上是反相色譜過程。為了最大限度地分離目標蛋白和雜質蛋白，采用逐步改變流動相的方法，用0.4硫酸銨洗脫雜質蛋白。

3.4在色譜過程的每一步鑒定激子的純度和活性，將目的蛋白稀釋到分級水平，并給煙葉注射器。24歲后可見壞死斑。

用308電泳法測定純度。純化后的目標蛋白與標準分子量蛋白均電泳。在97.4kd標準蛋白附近可見一條清晰的蛋白帶。