原文地址：http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2023/2/494575.shtm
2023年2月23日，北京大學程和平、王愛民團隊在 Nature Methods 在線發表題為“Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection”的文章（鏈接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3）。文中報道了重量僅為2.17克的微型化三光子顯微鏡（圖1），首次實現對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經元功能成像，為揭示大腦深部結構中的神經機制開啟了新的研究范式。
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圖1 小鼠佩戴微型化三光子顯微鏡實景圖
解析腦連接圖譜和功能動態圖譜是我國和世界多國腦計劃的一個重點研究方向，為此需要打造自由運動動物佩戴式顯微成像類研究工具。2017年，北京大學程和平院士團隊成功研制第一代2.2克微型化雙光子顯微鏡，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦皮層神經元和神經突觸活動的動態圖像。2021年，該團隊的第二代微型化雙光子顯微鏡將成像視野擴大了7.8倍，同時具備獲取大腦皮層上千個神經元功能信號的三維成像能力。
此次，北京大學最新的微型化三光子顯微鏡一舉突破了此前微型化多光子顯微鏡的成像深度極限：顯微鏡激發光路可以穿透整個小鼠大腦皮層和胼胝體，實現對小鼠海馬CA1亞區的直接觀測記錄（圖2），神經元鈣信號最大成像深度可達1.2 mm，血管成像深度可達1.4 mm。另外，在光毒性方面，全皮層鈣信號成像僅需要幾個毫瓦，海馬鈣信號成像僅需要20至50毫瓦，大大低于組織損傷的安全閾值。因此，該款微型三光子顯微鏡可以長時間不間斷連續觀測神經元功能活動，而不產生明顯的光漂白與光損傷。
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圖2 微型三光子顯微成像記錄小鼠大腦皮層L1-L6和海馬CA1的結構和功能動態。CC：胼胝體。綠色代表GCaMP6s標記的神經元熒光鈣信號，洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質界面的三次諧波信號。
海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個毫米。由于大腦組織，特別是胼胝體，具有對光的高散射光學特性，所以突破成像深度極限是長期以來困擾神經科學家的一個極大的挑戰。此前的微型單光子及微型多光子顯微鏡均無法實現穿透全皮層直接對海馬區進行無損成像。
北京大學微型化三光子顯微鏡成像深度的突破得益于全新的光學構型設計（圖3）。作者通過對皮層、白質和海馬體建立分層散射模型進行仿真，發現熒光信號從深層組織到達腦表面時已經處于隨機散射的狀態，使得顯微物鏡熒光收集效率降低，從而極大限制了成像深度。針對這一問題，經典阿貝聚光鏡結構被引入構型設計中：微型阿貝聚光鏡與簡化的無限遠物鏡密接可以提高散射光的通透效率；阿貝聚光鏡與激發光路中的微型管鏡部分復用，可以進一步簡化結構，降低損耗。總體上，新微型化顯微鏡的散射熒光收集效率實現了成倍的提升。
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圖3 微型化三光子顯微鏡光學構型
同時，利用微型三光子顯微鏡，作者研究了小鼠頂葉皮層第六層神經元在抓取糖豆這一感覺運動過程中的編碼機制：發現大約37%的神經元在抓取動作之前就開始活躍且在抓取時最活躍，大約5.6%的神經元在抓取動作之后開始活躍，說明不同神經元參與了不同階段的編碼（圖4）。這一結果初步展示了微型化三光子顯微鏡在腦科學研究中的應用潛力。
