游離核酸微量DNA樣本的檢測

近年來，DNA分析技術廣泛應用于醫學、法學、環境等諸多領域，成為科學研究的一大重點。例如產前診斷及法醫檢測等首先進行微量DNA 提取，然后進行PCR擴增驗證，也有一些研究單位會對一些古老樣本進行DNA提取，同樣做PCR擴增驗證。它們的相同之處在于，用于分析的樣本DNA含量可能極其有限，稍有遺損就可能導致無法成功檢測或者沒有足夠的樣本DNA來滿足再次檢測的需要。因此如何對獲得的極其微量的DNA樣本進行準確的定量，成為目前相關學科關注的熱點之一。

然而目前微量DNA的檢測方法靈敏度都不是很高，有些高端儀器雖然檢測時DNA樣本量很少，一般2μl左右，但是當DNA樣本濃度低于10ng/μl時，其檢測數據就會出現較大誤差。而由此導致的PCR擴增失敗，就會對DNA樣本造成損失，甚至導致樣本枯竭。因此開發一種經濟、簡便、快速的檢測手段顯得十分重要與迫切。北京百泰克生物技術有限公司開發的pgDetect微量核酸檢測系統可以對濃度在1ng/ul以下的樣本進行檢測。pgDetect微量核酸檢測系統的檢測靈敏度為5pg/μl，采用工業級CCD攝像機，有配套定量分析軟件；而DNA樣本用量僅需1-2μl。

pgDetect微量核酸檢測系統采用一種新型的dsDNA染料-Picogreen來進行檢測，其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA；檢測范圍寬，可跨越4個數量級；特異性好，基本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。目前使用Picogreen染料定量檢測DNA已經廣泛用于生物學檢測，并被2010年版《中華人民共和國藥典》選為藥物殘留DNA定量方法，本儀器的設計原理是通過在DNA溶液中加入Picogreen，使之發光，然后通過CCD相機捕捉光強度，zui后用pgDetect軟件進行濃度分析。

其操作步驟如下：

1 準備試驗樣品及已知濃度的雙鏈DNA，染料用Picogreen核酸染料.

2 標準品的濃度自行調整，一般雙鏈DNA的終濃度在10-2000 pg/μL的條件下，可以得到好的線性關系。將標準品稀釋至濃度為：1600，800，400，200，100，50，25 pg/μL及用于稀釋標準品dsDNA的蒸餾水做空白對照，作為對標準品的濃度檢測為例。

3 在透明管內進行操作，如可以使用PCR管或八連管等。將標準品與Picogreen核酸染料等體積混勻（如2 μL dsDNA溶液與2 μL Picogreen核酸染料混勻）此時標準品dsDNA的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5，0 pg/μL，同時取待測樣品2μL與2μL Picogreen核酸染料混勻。試驗操作完畢后，將反應管放在透射儀的藍色顯色板上，蓋上暗箱,打開電源觀測。此操作也可在藍色板上鋪一層透保鮮膜，將樣品和染料直接點到保鮮膜上，這樣透光更好，更有利于觀察。

4 DNA濃度分析：打開軟件，輸入標準DNA的濃度，將鼠標移至待測樣品，鼠標自動出現讀數，該讀數的zui大值為待測樣本的濃度。

應用實例

北京大學的羅教授，在做古老動物分類方面的研究，經常要提取一些保存了上百年甚至更長的動物組織的DNA，如骨頭，皮毛等。這些樣品多是從博物館中借的，非常珍貴。但是由于樣品存放時間過長，導致其中大部分的DNA都已降解，只有少量DNA殘留。這樣在提取時一般只能獲得很微量的DNA，提取DNA后要做PCR擴增保守序列然后再測序進行序列分析。但是由于缺乏微量DNA的檢測手段，因此無法控制在PCR反應時模板DNA的加量，從而導致PCR失敗，浪費了甚至比金子更珍貴的材料。在采用了百泰克生物技術有限公司的pgDetect微量核酸檢測系統后，該儀器檢測到37pg/μL的DNA濃度，達到了實驗室對DNA濃度的需求，從而可加入比較準確的模板DNA量，為PCR反應提供了支持。