溶菌酶（lysozyme）的制備及其性質實驗原理和操作(1)

【實驗內容】
1.溶菌酶Y活性檢測
⑴ 酶活力測定方法
⑵ 酶活力單位定義
⑶ 比活力定義
⑷ 蛋白含量測定方法
2. 蛋清溶菌酶的提取
⑴ 每組4～5個新鮮雞蛋
⑵ 利用等電點沉淀及樹脂層析等方法進行溶菌酶提取
3. 溶菌酶的分離、純化
⑴ 利用各種方法，從上述提取液分離
⑵ 每步純化前蛋白純度檢測
⑶ 分離純化過程中跟蹤檢測活性組份的蛋白質含量和酶活性
4. 溶菌酶理化性質
⑴ 溶菌酶的分子量測定
⑵ 溶菌酶的等電點測定
5. 溶菌酶的酶學性質
⑴ 在活力單位定義確定后，求出溶菌酶的Vmax和Km
⑵ 初步確定溶菌酶的最適pH
⑶ 初步確定溶菌酶的最適溫度
⑷ 提出最少兩種溶菌酶的可逆抑制劑并驗證抑制類型
⑸ 提出溶菌酶的激活性并驗證
(6) 溶菌酶的熱穩定性

【實驗原理】
溶菌酶（lysozyme）是由弗萊明在1922年發現的，它是一種有效的抗菌劑，全稱為 1，4-β-N-溶菌酶，又稱作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁質酶。活性中心為天冬氨酸52和谷氨酸35，是一種糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N- 乙酰氨基葡萄糖（NAG）與N-乙酰胞壁酸（NAM）間的β-1，4糖苷鍵，相對分子質量14700Da，由129氨基酸殘基構成，由于其中含有較多堿性氨基酸殘基，所以其等電點高達10.8左右，最適溫度為50OC，最適PH為6～7左右。在280nm的消光系數 為 13.0。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶廣泛存在于動植物及微生物體內，雞蛋(含量約為2%～4%)和哺乳動物的乳汁是溶菌酶的主要來源，目前，溶菌酶仍屬于緊銷的生化物質，廣泛應用于醫學臨床，具有抗感染、消炎、消腫、增強體內免疫反應等多種藥理作用。
溶菌酶常溫下在中性鹽溶液中具有較高天然活性 ，在中性條件下溶菌酶帶正電荷，因此在分離制備時，先后采用等電點法，D152型樹脂柱層析法除雜蛋白，再經Sephadex G-50層析柱進一步純化。最后用SDS-PAGE 鑒定為一條帶。采用福林酚法測蛋白含量，分光光度法測定酶活性。

【實驗材料】
1.實驗器材
循環水式真空泵HSB-IⅡ; 蛋白紫外檢測儀; 記錄儀; 紫外分光光度計; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度計; 冰凍離心機；冰箱；透析袋；酸度計；部分收集器；恒流泵；圓盤電泳裝置；恒溫水浴鍋；層析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸濾瓶 (1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)
2．實驗試劑
⑴ 雞蛋清（鮮雞蛋）
⑵ 底物微球菌粉
⑶ D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂
⑷ 固體氯化鈉（NaCl）；固體硫酸銨(NH4)2SO4；固體磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）；固體磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）；固體磷酸鈉（Na3PO4）
⑸ 乙醇；蒸餾水；甲醇；考馬斯亮藍；三氯醋酸；丙酮
(6) 溶菌酶標準品；Sephadex G50
⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸銅；硫酸亞鐵；硫酸鋅；氯化鎂；氯化鈣；氫氧化鈉；鹽酸
⑻ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑;蛋白含量測定（福林法）試劑
⑼ 聚乙二醇-20000、兩性電解質
【實驗操作】
1.蛋清的制備
將4～5個新鮮的雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出（雞蛋清pH 值不得小于8），輕輕攪拌5分鐘，使雞蛋清的稠度均勻，用兩層紗布過濾除去臍帶塊，量體積約為100ml。