溶菌酶（lysozyme）的制備及其性質實驗原理和操作(2)

2.雞蛋清粗分離
按過濾好的蛋清量邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用1mol/L HCl調pH值至7左右，用脫脂棉過濾收濾液。
3.D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析
⑴ D152樹脂處理：將D152樹脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用1mol/L NaOH攪拌浸泡并攪拌4～8小時，抽濾干NaOH,  用蒸餾水洗至近pH7.5, 抽濾干, 再用1mol/L HCl按上述方法處理樹脂，直到全部轉變成氫型，抽濾干HCl ,  用蒸餾水洗致近pH5.5，保持過夜，如果pH之不低于5.0，抽濾干HCl,用2mol/LNaOH處理樹脂使之轉變為鈉型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5  0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡樹脂。
⑵  裝柱：取直徑40px，長度為750px的層析柱，自頂部注入經處理的上述樹脂懸浮液，關閉層柱出口，待樹脂沉降后，放出過量的溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉積至15～500px高度即可。于柱子頂部繼續加入  pH6.5, 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，使流出液pH為6.5為止，關閉柱子出口，保持液面高出樹脂表面25px左右。
⑶ 上柱吸附：將上述蛋清溶液仔細直接加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內，流速為1ml/min。
⑷ 洗脫：用柱平衡液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，濃度為0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液。
⑸ 聚乙二醇濃縮：將上述洗脫液合并裝入透析袋內，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。當濃縮到5mL左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。
(6) 透析除鹽：蒸餾水透析除鹽24小時。
4.Sephadex G50分子篩柱層析
⑴ 裝柱：先將用20%乙醇保存的Sephadex G50抽濾除去乙醇，用 6g/LNaCl溶液攪拌Sephadex  G50數分鐘，再抽濾，反復多次直至無醇味為此。(如果Sephadex G50是新的，則按實驗五中的方法處理凝膠)。加入膠體積1/4的6g/L  NaCl溶液，充分攪拌，超聲除去氣泡，裝入玻璃層析柱（1.6×1250px），柱床1125px。
⑵ 上樣：與實驗五中的方法相同。
⑶ 洗脫:樣品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脫液洗下柱壁上的樣品，連接恒流泵，使流速為0.5mL /min，用部分收集器收集，每10分鐘一管。
⑷ 聚乙二醇濃縮：合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮到5mL左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。
⑸ 透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時。收集透析液，量取體積。
5. 溶菌酶活力測定
⑴ 酶液配制：準確稱取溶菌酶樣品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸緩沖液配成1mg/ml的酶液，再將酶液稀釋成50μg/ml.
⑵ 底物配制：取干菌粉5mg加上述緩沖液少許，在乳缽中（或勻漿器中）研磨2分鐘，傾出，稀釋到15～25ml，此時在光電比色上的吸光度最好在0.5～0.7 范圍內。
5.3 活力測定：先將酶和底物分別放入25 OC恒溫水浴預熱10分鐘，吸取底物懸浮液4mL放入比色杯中，在450nm波長讀出吸光度，此為零時讀數。然后吸取樣品液0.2mL（相當于10μg酶），每隔30s讀1次吸光度，到90s時共計下四個讀數。
活力單位的定義是：在25℃，pH6.2，波長為450nm時，每分引起吸光度下降0.001為1個活力單位。
酶的活力單位數=△A450nm/t×0.001
比活力=酶的活力單位數/mg蛋白質
6. 蛋白質含量的測定
采用Folin-酚試劑法進行測定.
7. 純度檢測
采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法.
8. 理化和酶學性質的測定
學生可根據酶純化和活力測定的結果，運用已掌握的生化知識和實驗技能自行設計方案進行探索研究。

【實驗結果】