焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術原理

焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。

Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應（參見Pyrosequecing的原理），在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團（PPi）。

PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種 dNTP，繼續DNA鏈的合成。

瑞典 Pyrosequencing AB公司基于Pyrosequencing技術而研究開發的PSQ 96系統是一個理想的遺傳分析技術平臺，它既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的SNP檢測及等位基因頻率測定。我公司是國內最早引進PSQ 96 MA 技術平臺的公司之一，它具有以下優點：
不需要制膠，不需要毛細管，也不需要熒光染料和同位素。
10分鐘內可分析96個樣品的SNP，可滿足高通量分析的要求。
每個樣品孔都可進行獨立的測序或SNP分析，實驗設計靈活。
序列分析簡單，結果準確可靠。
Pyrosequencing技術的原理

Pyrosequencing是一項全新的DNA測序技術，可以快速、準確地測定一段較短的目標片段。其基本原理如下：

第1步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。
第2步：向反應體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。
第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數成正比。
第4步：反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。

第5步：加入另一種dNTP，使第2－4步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。
Pyrosequecing技術操作簡單，結果準確可靠，可應用于SNP位點檢測、等位基因頻率測定、細菌和病毒分型等領域。