煮沸裂解法提取質粒DNA

　　質粒是存在于細菌染色體外的一個或多個能獨立復制并穩定遺傳的小型環狀雙鏈DNA分子，其分子量一般在0.2-10KD范圍內。由于質粒分子小，便于分離和提取，可以攜帶目的基因進入細菌、動物細胞或植物體內進行擴增與表達。

　　質粒提取方法即去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

　　質粒提取是分子生物學實驗的基礎技能和基本要求，基因克隆實驗中常將經改造后的質粒作為運送基因的載體，質粒提取質量的好壞直接影響到酶切、連接、轉化等后續實驗，因而高效快速地從細菌細胞中分離純化質粒具有重要意義。

　　提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優缺點，根據不同的實驗目的可以采用合適的提取方法。

　　實驗室中常用堿裂解法提取質粒，該法操作簡便，但若明確其中主要試劑的作用，所提取的質粒DNA的純度及質量會更高。

　　下面簡單介紹一下堿裂法提取質粒。

　　原理

　　細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞，閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。

　　只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。

　　在SDS存在的條件下，堿水解是一項非常靈活的技術，它對E. coli的所有菌株都適用，并且其細菌培養物的體積可以從1-500mL以上。

　　主要試劑的作用原理

　　氫氧化鈉的作用：在堿裂解法中，氫氧化鈉的作用原理是使細胞膜由脂雙層結構向囊泡化轉變，從而使細胞裂解，氫氧化鈉的作用既能裂解細胞讓細胞內含物釋放出來，又是質粒DNA和染色體DNA得以分離的關鍵。

　　但是對革蘭氏陽性菌來說，提取質粒時不能直接使用堿裂解法，而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化，然后才用堿裂解法裂解細胞。這是因為革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌細胞壁結構的區別及特點不同。

　　十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)的作用：SDS其實也是一種細胞裂解劑，其裂解細胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。此處使用SDS是因為SDS通常用作蛋白質的變性劑和助溶劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質的二級和三級結構。

　　幾乎所有的蛋白質能溶解在SDS中，甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中，SDS使蛋白質變性后與DNA分開。

　　5mol/L的醋酸鉀溶液的作用：醋酸鉀溶液不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉，還使得溶液的酸堿度劇烈下降，避免染色體DNA長時間暴露于強堿環境而斷裂(斷裂后就不好去除)，又使得質粒可以復性。

　　此外，SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。

　　由于平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。

　　又由于高鹽條件也會導致SDS形成沉淀，而5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環境促進沉淀的原理，有時也可以利用l0mol/L醋酸銨來代替。

　　優點

　　堿裂解法在提取質粒時具有一箭雙雕的作用：一方面是將細胞裂解，另一方面是形成高堿性的環境，使染色體DNA和質粒DNA變性，為下一步質粒DNA的復性及與染色體DNA分離做準備。

　　鑒定

　　質粒提取以后，采用瓊脂糖電泳進行質粒DNA鑒定時，多數情況下能看到三條帶，但不是平常看到的超螺旋、線性和開環這三條帶。

　　堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，可以采用EcoRI來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。

　　如果不小心在溶液（即NaOH和SDS）加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7-10條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致，這里暫不深究。