生產苯丙氨酸工藝優化Lphe

L-苯丙氨酸已在國內江蘇部分廠家有發酵工業規模化生產，但仍然推薦此文供大家研究參考，了解工藝配方和分析方法。

L-苯丙氨酸(L-phe)是人和動物體內不能合成的8種氨基酸之一,人們稱其為必須氨基酸。L-phe在生物體內是轉化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成為一些氨基酸輸液和氨基酸飲膳所必須的成分。而且,L-phe是合成藥物麥角胺、抗生物質和維生素B6的重要原料。同時,L-phe也是合成一些抗癌藥物的中間體[1]。在食品工業中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味劑,俗稱蛋白糖。基于L-phe廣泛的應用前景,近年來L-phe成為氨基酸行業單品中產量增長最快的一種。目前,L-phe的生產方法有酶法、發酵法等,直接發酵法具有可利用廉價原料直接生產L-phe的優點,發酵法生產L-phe,國外報道產酸率為2.8%,L-phe在我國還未實現規模生產[2]。本實驗對構建的重組L-phe基因工程菌E.coLiHB101. 進行發酵實驗,研究了其發酵工藝條件及營養物質的流加對產物L-phe積累的影響。

1　實驗材料與方法

1.1　發酵用菌株基因重組工程菌E.coLiHB101. 。

1.2　培養基

1.2.1　種子培養基　蛋白胨1%;氯化鈉1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;調pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。

1.2.2　發酵培養基　Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamate0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖20g/L;Km40mg/L。

1.2.3　補料培養基　CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。

1.3　培養方法1.3.1　搖瓶培養　250mL錐形瓶內裝LB培養基25mL,接種菌種斜面后,于旋轉搖床上,在37℃培養12h。

1.3.2　深層培養

在2L自控發酵罐(美國進口)中裝入1L發酵培養基。滅菌后接入5%的搖瓶種子。通氣量為1000L/L·min時,于38.5℃下攪拌培養。攪拌轉速根據溶氧(DO)調節;使用28%的氨水調節pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工藝補料,補料速率由測定葡萄糖來控制。

1.4　測定方法

1.4.1　菌體濃度

通過測定培養液或其稀釋液在波長660nm處的吸光度OD660確定菌體濃度。一個OD660單位相當于0.267g/L(菌體干重)。當OD660<0.3時,有良好的線性關系。

1.4.2　殘糖濃度

用費林試劑法測定[3]。

1.4.3　發酵液中L-phe濃度分析

用熒光法進行測定[4]。

2　結果與討論

2.1　生長因子對苯丙氨酸積累的影響

隨著酪氨酸添加量的增加,產酸率提高,從發酵成本和產酸率兩方面分析,得出酪氨酸的最適添加量為1.0～1.2g/L,既可得高產酸率3.68%,又可使成本不致過高。

2.2　工藝與代謝副產物乙酸對苯丙氨酸的影響

通過對發酵工藝條件優化,實驗得出:當發酵溫度控制在38～39℃,溶解氧(DO)控制在20%,在整個實驗過程中葡萄糖濃度維持在1.5%,既有利于苯丙氨酸的積累,又能有效抑制乙酸的產生,苯丙氨酸的濃度可達到3.86%

3　結　論

1)獲得了L-phe發酵的優化工藝參數為:攪拌轉速450r/min,發酵溫度為38.5℃,DO控制在20%,發酵液pH值為7.0,糖濃度控制在1.5%,酪氨酸添加量為1.0～1.2g/L。另外,分析了上述工藝條件對菌體細胞生長和L-phe積累的影響。

2)溶氧控制的葡萄糖流加補料和酪氨酸分批補料雙重調控可以有效地控制菌體比生長速度,減少乙酸產生,提高菌體濃度和L-phe濃度。

3)經十幾批發酵條件的摸索和5批穩定發酵,該菌種重組質粒穩定,重復性好,平均產酸量36.8g/L。

生產過程中運用離心機：R-Phe Centrifuge