生化實驗講義(理論部分)——層析技術（五）

  柱床體積Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預定標記處，然后測量水的體積來測定。外水體積Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質的洗脫體積來測定，一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質。因為它的分子量大（為200萬），在各種型號的凝膠中都被排阻，并且它呈藍色，易于觀察和檢測。
  2. 分配系數
      分配系數是指某個組分在固定相和流動相中的濃度比。對于凝膠層析，分配系數實質上表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。
  3. 排阻極限
      排阻極限是指不能進入凝膠顆粒孔穴內部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如Sephadex G-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。
  4. 分級分離范圍
      分級分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對于分子量在這個范圍內的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如Sephadex G-75對球形蛋白的分級分離范圍為3,000－70,000，它表示分子量在這個范圍內的球形蛋白可以通過Sephadex G-75得到較好的分離。應注意，對于同一型號的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級分離范圍是不同的。
  5. 吸水率和床體積
      吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。而床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。
  6. 凝膠顆粒大小
      層析用的凝膠一般都成球形，顆粒的大小通常以目數（mesh）或者顆粒直徑（m）來表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。一般比較常用的是100－200目。 3.2.4 凝膠的種類和性質
      凝膠的種類很多，常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠（dextran）、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）、瓊脂糖凝膠（agarose）以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯物。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等。下面將分別介紹。
  1. 葡聚糖凝膠
      葡聚糖凝膠是指由天然高分子－葡聚糖與其它交聯劑交聯而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech生產。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。
      葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列，它是葡聚糖與3－氯－1,2環氧丙烷（交聯劑）相互交聯而成，交聯度由環氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號是G-10 ? G-200，后面的數字是凝膠的吸水率（單位是ml / g干膠）乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干膠。Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。Sephadex中排阻極限最大的G-200為6?105。Sephadex在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩定的，可以多次重復使用。Sephadex穩定工作的pH一般為為2－10。強酸溶液和氧化劑會使交聯的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex與強酸和氧化劑接觸。Sephadex在高溫下穩定，可以煮沸消毒，在100 ?C下40 min對凝膠的結構和性能都沒有明顯的影響。Sephadex由于含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團（尤其是堿性蛋白）發生吸附作用。但一般在離子強度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex與蛋白發生吸附，但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發生較大的變化。Sephadex有各種顆粒大小（一般有粗、中、細、超細）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細顆粒流速慢，但分辨率高。要根據分離要求來選擇顆粒大小。Sephadex的機械穩定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現快速而高效的分離。
      另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應，形成LH型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機溶劑為流動相，分離脂溶性物質，例如膽固醇、脂肪酸激素等。
      Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（N, N’-methylenebisacrylamide）交聯而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。Sephacryl的優點就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達到108，遠遠大于Sephadex的范圍。所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質粒、甚至較大的病毒顆粒。 Sephacryl與Sephadex相比另一個優點就是它的化學和機械穩定性更高：Sephacryl在各種溶劑中很少發生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl穩定工作的pH一般為
3~11。
      另外Sephacryl的機械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl相比Sephadex可以實現相對比較快速而且較高分辨率的分離。
  2. 聚丙烯酰胺凝膠
      聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺（acrylamide）與甲叉雙丙烯酰胺交聯而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯度的產物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-Rad Laboratories生產，商品名為Bio-Gel P，主要型號有Bio-Gel P-2 ? Bio-Gel P-300等10種，后面的數字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數字越大，可分離的分子量也就越大。各種型號的主要參數如附表所示。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-Gel P-300為4?105。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中都比較穩定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩定性較好，在pH為1~10之間比較穩定。但在較強的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發生分解。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，所以吸附效應較小。另外，聚丙烯酰胺凝膠不會象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強度略高的洗脫液就可以避免。
  3. 瓊脂糖凝膠
      瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脫水半乳糖（anhydrogalactose）交替構成的多糖鏈。它在100 ?C時呈液態，當溫度降至45 ?C以下時，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環的瓊脂糖，經凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的商品名因生產廠家不同而異，常見的主要有Pharmacia Biotech生產的Sepharose（2B ? 4B）和Bio-Rad Laboratories生產的Bio-gel A等。關于各種瓊脂糖凝膠的基本參數如附表所示。瓊脂糖凝膠在pH為4－9之間是穩定的，它在室溫下很穩定，穩定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小。另外瓊脂糖凝膠的機械強度和孔穴的穩定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時洗脫速度可以比較快。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0－30 ?C為宜。
      Sepharose與2,3二溴丙醇反應，形成Sepharose CL型凝膠（CL-2B ? CL-4B），它們的分離特性基本沒有改變，但熱穩定性和化學穩定性都有所提高，可以在更廣泛的pH范圍內應用，穩定工作的pH范圍為3－13。Sepharose CL型凝膠還特別適合于含有有機溶劑的分離。
  4. 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯凝膠
      這類凝膠是由交聯的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內部的瓊脂糖組成。它們主要由LKB提供，商品名為Ultragel。這種凝膠由于含有聚丙烯酰胺，所以有較高分辨率；而它又含有瓊脂糖，這使得它又有較高的機械穩定性，可以使用較高的洗脫速度。調整聚丙烯酰胺和瓊脂糖的濃度可以使Ultragel有不同的分離范圍，
  5. 多孔硅膠、多孔玻璃珠
      多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于無機凝膠。顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網孔狀結構的球形顆粒。這類凝膠屬于硬質無機凝膠，它們的最大的特點是機械強度很高、化學穩定性好，使用方便而且壽命長，無機膠一般柱效較低，但用微粒的多孔硅膠制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以達到4?104塔板 / 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填裝緊密，所以柱效相對較低。多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為102－5?106，多孔玻璃珠一般為3?103－9?106。它們的最大缺點是吸附效應較強（尤其是多孔硅膠），可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。另外它們也不能用于強堿性溶液，一般使用時pH應小于8.5。
      另外值得一提的是各類凝膠技術近年來發展得很快，目前已研制出很多性能優越的新型凝膠。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化學物理穩定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析；而Superose的分離范圍很廣，分辨率較高，可以一次性的分離分子量差異較大的混合物。同時它的機械穩定性也很好。關于各種凝膠產品的詳細情況可以參閱本書附錄以及各個公司的產品目錄。
3.2.5 凝膠的選擇、處理和保存
  1. 凝膠的選擇
      通過前面的介紹可以看到凝膠的種類、型號很多。不同類型的凝膠在性質以及分離范圍上都有較大的差別，所以在進行凝膠層析實驗時要根據樣品的性質以及分離的要求選擇合適的凝膠，這是影響凝膠層析效果好壞的一個關鍵因素。
      一般來講，選擇凝膠首先要根據樣品的情況確定一個合適的分離范圍，根據分離范圍來選擇合適型號的凝膠。一般的凝膠層析實驗可以分為兩類：分組分離（group separations）和分級分離（fractionations），分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質以及一些注射劑去除大分子熱源物質等等。分級分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開。在分組分離時要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。分級分離時則要根據樣品組分的具體情況來選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應包括所要的各個組分的分子量，另一方面要合適，不能過大。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離；如分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果也不好。
      選擇凝膠另外一個方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散現象嚴重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當也可以得到滿意的結果。選擇時要依據分離的具體情況而定，例如樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達到分離的目的；如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。由于凝膠一般都比較穩定，所以它在一般的實驗條件下都可以正常的工作。如果實驗條件比較特殊，如在較強的酸堿中進行或含有有機溶劑等等，則要仔細查看凝膠的工作參數，選擇合適的類型的凝膠。
  2. 凝膠的處理
      凝膠使用前要首先要進行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無水的干膠，所以要計算干膠用量：干膠用量（g）＝柱床體積（ml）/ 凝膠的床體積（ml / g）。 由于凝膠處理過程以及實驗過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計算的基礎上再增加10％－20％。
      葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠干膠的處理首先是在水中膨化，不同類型的凝膠所需的膨化時間不同。一般吸水率較小的凝膠（即型號較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時間較短，在20 ?C條件下需3－4小時；但吸水率較大的凝膠（即型號較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時間則較長，20 ?C條件下需十幾個到幾十個小時，如Sephadex G-100以上的干膠膨化時間都要在72小時以上。如果加熱煮沸，則膨化時間會大大縮短，一般在1－5小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。
      膨化處理后，要對凝膠進行純化和排除氣泡。純化可以反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質和不均一的細小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。
  3. 凝膠的保存
      凝膠的保存一般是反復洗滌去除蛋白等雜質，然后加入適當的抗菌劑，通常加入0.02％的疊氮化鈉，4 ?C下保存。如果要較長時間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50％的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復浸泡脫水，至95％乙醇脫水后將凝膠抽干。置于60 ?C烘箱中烘干，即可裝瓶保存。注意膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結構。
3.2.6 凝膠層析的基本操作
      凝膠層析的基本操作步驟與前面介紹的柱層析的操作過程基本相似，這里就不再重復了。下面主要介紹凝膠層析操作中應注意的一些具體問題。
  1. 層析柱的選擇
      層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。
  2. 凝膠柱的鑒定
      凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關于填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以采用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。
  3. 洗脫液的選擇
      由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格。由于凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。
  4. 加樣量
      關于加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那么加樣量不能超過（Ve1－Ve2）。實際由于樣品擴散，所以加樣量應小于這個值。從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。