| 實驗步驟 |
材料
緩沖液與溶液
貯存液、緩沖液與試劑的成分見附錄1。
稀釋貯存液至所需濃度
CaCl2(2.5mol/L)
乙醇
未曾打開過的純乙醇一瓶。乙醇有吸濕性，在空氣中會吸收水分。在下述方法中. 第 1、2、3步用含水的乙醇洗滌會影響細胞與組織的有效轉染。
甘油（50% 水溶液）
高壓滅菌。
亞精胺（0.1mol/L)
用去離子水溶解適量亞精胺（無堿型)，用0.22um濾器過濾除菌。溶液等分為小份，-20°C保存。毎月制備新的貯存液。
核酸與寡核苷酸
質粒DNA
如果是第一次用基因槍轉染一種新細胞系或組織，應使用編碼適當標記基因的表達質粒來優化轉染條件。例如表達E.coli.β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶（植物）或如新霉素抗性等選擇性標記的載體。實驗過程優化后可使用表達目的基因或cDNA的質粒。
在生物粒子轉染過程中. 是否可以使用用各種含有不同量脂多糖的層析樹脂純化的質粒DNA, 研究者對此意見不一。顯然. 即使有少量內毒素/脂多糖污染質粒DNA, 轉染效率也會降低建議使用CsCl-溴化乙錠離心純化質校DNA(見第1章方案10)。用H2O溶解純化的質粒DNA至終濃度1ug/ul。
培養基
細胞生長培養基[完全培養基與（備選）選擇性培養基]
特殊設備
基因槍
通常使用
Biolistic PDS-1000/He粒子轉運系統，Bio-Rad
公可生產，包括分隔真空與氦線連接的轟擊室。需要一個能夠產生5英寸汞柱的泵通常，家用真空線不能用于此實驗。固定于工作臺或墻壁的高壓(2400-2600psi)氦罐（純度>9.999%)
與僅器連接。
金或鎢粒子（微載體）
用于轉染細胞的 DNA 通過直徑 0.6um 至 5um 鎢或金粒子轉移到細胞中，對于特定的細胞或組織最佳粒子直徑由經驗確定。粒子從公司購買（如 Bio-Rad公司或 Sylvania 公司）按照下述第一步制備 DNA 包被。
鏡頭紙
微量離心管（1.5 ml)
使用質量好的離心管。有些品牌或批次的離心管會過量結合基因槍實驗中用作彈頭的膠狀粒子。
附加試劑
本方案第 8 步可能需要第17 章方案 7 所列試劑。
細胞與組織
需轉染的細胞或組織
各物種的貼壁培養細胞可在生長至 50%~80% 匯合度時轟擊轉染。懸浮生長的植物細胞用Buchner 濾器 Whatman1 號濾紙（直徑 7 cm) 過濾，將收集的細胞置于浸有高滲培養基的無菌濾紙上（詳情見 Sanford et al.1993)。
新解剖的哺乳動物組織切成約 400um 左右的片狀，轟擊前按照 McAllister 等（1995) 介紹的方法置于培養皿中。
培養的細菌與酵母根據其種屬及株于中或晚對數期離心收集，重懸于少量高滲培養基中，轟擊前平鋪于濾紙上的薄層瓊脂上（1x108~2x109 細胞)，濾紙置于 Petri 平皿中。
方法
1. 制備鎢或金粒子
a. 稱 60 mg 鎢或金顆粒置于 1.5 ml 離心管中。
b. 在顆粒中加入 1 ml70% 乙醇，室溫下持續振蕩 5 min, 離心管于工作臺上放置 15 min。
c. 高速離心 5s 收集粒子。
d. 輕輕棄去上清，用 1 ml 滅菌水重懸粒子，振蕩 1 min。離心管于工作臺上放置 1 min。
e. 髙速離心 5S 收集粒子。
f. 再用水洗滌 3 次以上（按步驟 d 與 e)。
g. 第 4 次洗滌后棄去上清，用 1 min50% 甘油重懸粒子。
洗滌后的粒子濃度應達到 60 mg/ml, 室溫下可保存 1~2 周。長時間放置會氧化，從而降低轉染效率。
2. 每 6 個平皿的細胞或組織，按下述方法制備一份 DNA 包被的粒子：
a. 在持續振蕩粒子貯存液的情況下，吸取 50ul(約 3 mg)。
b. 轉移至離心管中，邊振蕩邊加入下列溶液：
質粒 DNA(約 2.5ug） 2.5ul
2.5mol/L-CaCl2 50ul
0.1mol/L 亞精胺 20ul
加入上述試劑后，再持續振蕩 3 min。
此過程中持續振蕩是非常必要的，可以保證 DNA 均勻包被粒子。
c. 離心管于工作臺上放置 1 min 使粒子沉淀，高速離心 2s 收集粒子。
長時間離心會導致金屬粒子聚集成塊，降低轉染效率。
d. 棄去上清，加 70% 乙醇 140ul 于粒子沉淀上。棄去 70% 乙醇，在不動粒子的情況加 100% 乙醇 140ul, 棄去上清，加入 50ul 乙醇。
e. 輕輕敲擊離心管側壁使粒子重新懸浮，輕輕振蕩 2~3%
3. 生產商提供的固定裝置將一個大載玻片固定于基因槍的金屬支架上。用 6ul 乙醇洗滌玻片 2 次，每次洗完用鏡頭紙擦干。
4. 振蕩第 2 步的沉淀 1 min, 振蕩時，吸取 6ul 懸液（約 500ug 粒子）快速鋪于載玻片中心 1 cm 范圍的區域上。
5. 重復步驟 3 與 4, 直至所需載玻片上均鋪好粒子。使含 DNA 包被粒子的乙醇懸液在載玻片上干燥。
6. 載玻片置于基因槍上，按照操作說明轟擊細胞平皿或組織片。
7. 當氣壓恢復至大氣壓時，移開損傷的細胞或組織，將其置于適當的培養條件下。棄去斷裂的載玻片，重復步驟 6 與 7, 直至所有平皿均受到轟擊。
8. 如要獲得穩定轉化，直接進行第 9 步。如要瞬時表達，則于轟擊 24~96 h 后用下述方法之一檢測細胞：
? 如果使用的是表達 E.coli.β-半乳糖苷酶的質粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步驟檢測細胞裂解液中酶活性。或者按照本章方案 1 的附加方案中介紹的組化染色方法操作。
? 如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在 450~490nm 光照下用顯微鏡檢測細胞。
? 如果使用表達β-葡萄糖醛酸酶的質粒 DNA, 按照后面附加方案：單層細胞組化染色鑒定 P-葡萄糖醛酸酶中介紹的方法檢測β-葡糖醛酸酶活性。
? 如果表達的是其他基因產物，則通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
為減小不同培養皿之間轉染效率的差異，最好（1）用每一構建體轉染數個培養皿（2） 孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；（3） 將細胞匯集起來；以及（4） 重鋪細胞于數個培養皿上。
9. 分離穩定轉染體：用完全培養基培養 48~72 h 后，將受轟擊的細胞轉移至選擇性培養基。選擇性試劑的濃度與培養條件根據細胞類型而定。
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