用一步法從細胞和組織中同時制備DNA、RNA和蛋白質

源細胞或組織

氯仿 乙醇 異丙醇 液氮 單相裂解試劑 磷酸緩沖鹽溶液 RNA 沉淀液 乙酸鈉

Sorvall H1000 轉頭或與之相當的轉頭 Sorvall SS-34 轉頭或與之相當的轉頭 比色杯 勻漿器 研缽和研杵 帶螺帽的聚乙烯管 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

氯仿

乙醇
 
異丙醇

液氮

單相裂解試劑



磷酸緩沖鹽溶液（PBS), 冰冷

RNA 沉淀液（1.2 mol/L NaCl，0.8 mol/L 檸檬酸二鈉鹽·15H₂O（不需要調 pH）

乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)

2. 細胞和組織

源細胞或組織

3. 離心機和轉頭

Sorvall H1000 轉頭或與之相當的轉頭

Sorvall SS-34 轉頭或與之相當的轉頭

4. 專用設備

測量 260 nm 吸光度的比色杯

勻漿器（如Tekmar-Dohrmann 的組織勻漿器和 Brinkmann 的 polytron 勻漿器）

研缽和研杵

帶螺帽的聚乙烯管

水浴，預設定 65℃

二、方法

1. 準備分離 RNA 的細胞或組織樣品

(1) 組織

① 解剖所要的組織，將其直接放入液氮中速凍。

② 將 100 mg 冰凍組織放液氮的研缽中，用研杵碾碎組織。在研磨過程中要不斷添加液氮以保持組織冷凍。

③ 將粉末狀的組織移入一個盛有 1 ml 冰冷單相液的聚乙烯螺帽管中。

④ 于室溫用 polymm 勻漿器高速勻漿組織 15~30s。

(2) 懸浮生長的哺乳動物細胞

① 用臺式離心機于室溫以 200~900 g（Sorvall H1000 轉頭為 1000~3000 r/min) 離心 5~10 min, 收集細胞。

② 吸出培養液，用 1~2 ml 無菌冰冷的 PBS 重懸細胞沉淀。

③ 離心收集細胞，吸盡 PBS, 每 10⁶ 細胞加 1 ml 單相裂解劑。

④ 于室溫，用勻漿器高速勻漿細胞 15~30s。

(3) 單層生長的哺乳動物細胞

① 吸出培養液，用 5~10 ml 無菌冰冷的 PBS 洗滌細胞一次。

② 吸出 PBS, 每個直徑 90 mm 培養皿中的培養細胞用 1 ml 單相裂解劑裂解細胞（每個直徑 60 mm 培養皿加 0.7 ml 單相裂解劑）。

③ 轉細胞裂解液于一螺帽聚乙烯管中。

④ 于室溫用勻漿器高速勻漿細胞裂解物 15~30s。

2. 于室溫將細胞勻漿物溫育 5 min 使核蛋白復合物完全解離。

3. 加入 0.2 ml 氯仿于每毫升單相裂解劑中，通過劇烈搖動或用旋渦震蕩器混勻樣品。

4. 于 4℃ 以 12000 r/min （Sorvall SS-34 轉頭 10000 g）離心 15 min 使混合物分為兩相， 將上層水相移至一個新的離心管中。

5. 從水相中沉淀 RNA: 每 1 ml 單相裂解劑，加入 0.25 倍體積的異丙醇和 0.25 倍體積的 RNA 沉淀液。充分混勻后，于室溫放置 10 min。

6. 于 4℃ 以最大轉速離心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗滌沉淀兩次，重復上述離心。用一次性使用的吸頭吸盡殘存的乙醇。將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發殆盡。不要讓 RNA 沉淀干透。

7. 加 50~100 μl DEPC 處理過的水。將 RNA 溶液貯存于 -70℃。

加 SDS 至終濃度 0.5%，然后加熱至 65℃ 有助于 RNA 沉淀的溶解。

8. 估計 RNA 的濃度。