用于蛋白質表達和純化的pET32α（+）載體的構建

表達載體的構建是生物技術和所需蛋白質產生的基本工具，本文總結了pET-32α（+）載體技術的構建，該技術通常用于研究實驗室。該方法包括獲得用于構建載體的外源DNA片段，將DNA片段亞克隆到pET-32α（+）表達載體中，在大腸桿菌 BL21（DE3）中進行蛋白質表達以及在大腸桿菌中在天然條件下進行蛋白質純化。裂解液。

介紹

作為分子生物學實驗室中非常有用的實踐，重組DNA技術（或基因克隆）是指將DNA片段從一種生物體轉移到自我復制的遺傳元件如表達載體。然后插入的DNA可以在外源宿主細胞中繁殖，或者可以表達以產生重組蛋白。pET-32α（+）載體系列用于表達與109 aa Trx?Tag?硫氧還蛋白融合的肽序列。它屬于一種表達系統，可在其激活后產生所需的蛋白質。插入原核宿主細胞。原核細胞如大腸桿菌因為它們廉價，快速的生物量積累和簡單的工藝規模擴大，因此是外源蛋白表達的首選宿主。

在本文中，我們將重點總結這種在我們的實驗室中使用的有用技術。表達后pET-32α（+）載體的構建，蛋白質表達和蛋白質純化將在本文中詳細描述。

獲得用于構建載體的外源DNA片段

插入載體的DNA通常可以使用聚合酶鏈式反應（PCR）從倍增基因獲得，也可以來自人工合成的基因。通過PCR獲得感興趣的DNA的方法是：首先，分離含有感興趣的DNA片段的mRNA的總RNA，并通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）將RNA逆轉錄成cDNA。根據公布的NCBI基因編碼序列（CD）設計寡核苷酸引物，并在引物中加入指定的限制酶位點。然后，通過PCR擴增感興趣的DNA的編碼區，用凝膠提取試劑盒純化后，將DNA片段插入克隆載體中。

通過RT-PCR將RNA逆轉錄成cDNA

通過PCR擴增感興趣的DNA的編碼區

經驗

雖然從RT-PCR中獲取DNA片段是常用的方法之一，但可能會出現許多問題并導致一些意想不到的結果，這里有一些關于如何獲得高質量DNA片段的經驗：在開始分離RNA的步驟中，確保所有加工步驟都應在無RNases的環境中進行，并在室溫下快速充分均化樣品。RNA的高純度和完整性對于合成全長cDNA是必需的，而后者用于高質量PCR產物。除了符合設計引物的基本規則外，如果我們希望稍后表達，設計的引物必須能夠將模板DNA從起始密碼子擴展到終止密碼子。將限制性位點引入引物的5'末端時。

故障排除

有時可能會出現低模板質量或數量，導致產量低或沒有PCR產物，為避免這種情況，確保在cDNA合成之前評估RNA的完整性，并通過洗滌去除RNA純化方案中使用的痕量試劑RNA顆粒完全含有75％乙醇。錯誤的PCR產物也可能由故障引物設計和次優的熱循環條件引起，因此如果發生這種情況，最好重新設計引物并優化熱循環條件和反應條件。不要忘記在PCR中使用高保真的熱穩定DNA聚合酶，并將PCR產物暴露在紫外線下幾秒鐘以避免序列錯誤。在限制酶位于引物中之前，需要添加額外的堿基以進行有效的切割。

將DNA片段亞克隆到pET-32α（+）表達載體中

由具有指定限制性酶切位點的公司合成編碼區的基因片段，其由5'末端的stat密碼子（ATG）和3'末端的終止密碼子（TAA，TAG或TGA）結合。然后將目的基因片段插入pMD18-T載體中以構建重組質粒，通過DNA測序鑒定。用指定的酶消化重組pMD18-T質粒，并通過以下方案將檢索到的目的DNA片段亞克隆到pET-32α（+）載體中以產生重組表達載體。

將約129bp的TBO基因片段插入pET-32α（+）載體（5900bp）

1. 用相同的限制酶在37℃消化pET-32α（+）載體和重組pMD18-T載體1小時，然后通過在65℃溫育10分鐘加熱滅活酶。

2. 通過凝膠提取試劑盒純化消化的pET-32α（+）載體骨架和從pMD18-T載體切下的基因片段。

3. 用T4 DNA連接酶在23℃下用pET-32α（+）載體骨架連接基因片段1小時，載體末端和插入末端的比例為1：3（fmol）。

4. 將10μl連接反應與100μl感受態大腸桿菌 BL21（DE3）在冰上混合10分鐘，并將混合物在42℃下孵育90秒。加入800μlLB并在37°C下孵育40分鐘。涂在含有100μg/ ml氨芐青霉素的LB平板上。在37°C孵育過夜。

5. 通過菌落PCR篩選插入物的存在或制備DNA并用指示限制酶消化。

   

通過限制酶消化鑒定插入物的存在。M：DNA標記，1：用BamHI / SalI消化后的重組pET-32α（+）載體

經驗

有時通過PCR仍然難以獲得DNA產物，因為引物被定義為具有起始密碼子和終止密碼子的有限區域，因此人工合成所需的基因是獲得DNA片段的替代選擇。根據我們的經驗，表達載體很大或具有低拷貝數，因此更有效的方法是首先將DNA片段克隆到非表達載體中，然后將其亞克隆到表達載體中。確保在感受態細胞中設置沒有載體的陰性對照和在轉化期間在大腸桿菌細胞中單獨使用空載體的陽性對照。

故障排除

1.低產量或無轉化體：原因可能是感受態大腸桿菌細胞的轉化效率非常低，因此在轉化前用空載體DNA檢查轉化效率。用于轉化的過量的連接混合物或用于連接的過量的連接酶也可能導致該問題。在轉化之前，確保DNA片段不含有污染物（例如，過量的鹽，EDTA，蛋白質，苯酚等），并在結扎前適當地用正確的限制酶消化。2.沒有插入的空載體：這可能是由載體再循環或不完全載體切割引起的，試圖使載體去磷酸化并檢查瓊脂糖凝膠上的切割效率可能有助于您解決這個問題。3.插入序列錯誤：PCR引物中的錯誤和PCR中使用的低保真DNA聚合酶可能會導致此問題。

大腸桿菌 BL21（DE3）中的蛋白質表達

重組pET-32α（+）載體可以表達所需的蛋白質，其在被異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導后與大腸桿菌 BL21（DE3）中的109aa Trx?Tag TM融合。首先，將含有100μg/ ml氨芐青霉素的10ml LB培養基與含有重組pET-32α（+）載體的新鮮細菌菌落一起接種37℃過夜; 然后，將500-μl過夜培養物加入到含有100-μg/ ml氨芐青霉素的30-ml新鮮LB培養基中，在37℃接種直至OD 600 = 0.6。加入IPTG至終濃度為1 mM，在200轉/分鐘的振蕩器中將培養物在32℃培養5小時之后，通過以4000g離心15分鐘收獲細胞。為了鑒定融合蛋白在細胞中的表達，首先，在IPTG誘導之前和之后收集一部分細胞，以4000g離心15分鐘，然后用PBS重懸沉淀并在冰上超聲處理，收集上清液。分別和沉淀，并通過SDS-PAGE凝膠分析。

接種大腸桿菌 BL21用于蛋白質表達

IPTG誘導的融合蛋白的SDS-PAGE分析。通過SDS-PAGE分離蛋白質并用考馬斯亮藍染色。泳道1：蛋白質分子量標記; 泳道2：未誘導的BL-21 / pET32a（+）/ pTBO超聲處理后的上清液; 泳道3：誘導BL-21 / pET 32a（+）/ pTBO超聲處理后沉淀; 泳道4：BL-21 / pET 32a（+）/ pTBO超聲處理誘導5小時后的上清液。pTBO融合蛋白的分子量約為22kDa。

經驗

對于原核物種中的異源蛋白質表達，首先，我們需要優化通常用于大腸桿菌的密碼子。其次，在培養基中加入IPTG后，讓培養物生長不同的時間點，如3小時，6小時，12小時18小時，并在37°C，30°C，21°C或不同的溫度下嘗試不同的溫度。在18°C，選擇優化的蛋白質表達條件，這可能會增加表達蛋白質的溶解度。

故障排除

嘗試較低的生長溫度和較低的誘導劑濃度可以避免包涵體的形成，并有助于一些不正確的二硫鍵形成和疏水蛋白的情況。為了保護蛋白質，我們可以在培養后向培養基中加入蛋白酶抑制劑，并在冰上破碎細胞以避免降解。

在大腸桿菌裂解物中在天然條件下的蛋白質純化

Trx?Tag?是移植到重組蛋白上的肽序列，可以通過腸激酶去除。這種蛋白質標簽是一種增稠標簽，可以幫助蛋白質正確折疊并防止它們沉淀。由重組pET-32α（+）載體表達的融合蛋白也含有經常用于親和純化的His-Tag，該His-Tag也可用于通過蛋白質印跡純化后鑒定融合蛋白。以下是通過Ni-NTA旋轉試劑盒（QIAGEN）在天然條件下純化蛋白質的方法。

蛋白質印跡分析融合蛋白的表達。在大腸桿菌 BL21菌株中表達TBO的融合蛋白，經NI-NTA旋轉試劑盒純化后，使用抗His標簽抗體通過Western印跡分析蛋白質。Trx。Tag + TBO為22 KDa

1. 將來自5-ml培養體積的沉淀重懸于630μl裂解緩沖液（NPI-10）中，在冰上以30秒的間隔超聲處理細胞懸浮液10秒短暫10秒。

2. 在4℃下以12,000g離心裂解物20分鐘并收集上清液。

3. 用600μl緩沖液NPI-10平衡Ni-NTA離心柱，以890g離心2分鐘。

4. 將含有6×His標記蛋白的600-μl裂解液加載到預平衡的Ni-NTA離心柱上，以270 g離心5分鐘并收集流通液

5. 用600μl緩沖液NPI-20洗滌Ni-NTA離心柱三次，以890g離心2分鐘。

6. 用300μl緩沖液NPI-500洗脫蛋白質兩次，以890g離心2分鐘并收集洗脫液。

經驗

如果緩沖液中的固體顆粒阻塞旋轉柱，則應首先過濾該方案中使用的所有緩沖液，并確保緩沖液含有精確濃度的咪唑。不要忘記在每個步驟中收集流通液，這樣您就可以檢查洗脫液中洗脫的蛋白質類型。NI-NTA旋轉柱是可重復使用的，這意味著在NPI-10再次平衡后，旋轉柱可以使用兩到三次。

故障排除

1. 蛋白質不與NI-NTA離心柱結合：首先，這可能是由于錯誤的結合條件引起的，例如緩沖液中pH值較低和咪唑濃度較高。其次，6×His標簽在蛋白質中不存在或不可接近，因此如果緩沖液中的咪唑的pH值和濃度正確，則應再次檢查表達構建。

2. 蛋白質在洗滌緩沖液中洗脫：這可能是因為洗滌嚴格性太高或錯誤的緩沖條件，對于這個問題，降低咪唑濃度或略微增加pH值有時可能有所幫助。

3. 純化過程中蛋白質沉淀：這將在環境溫度過低時發生，因此在室溫下進行純化可能比將其置于冰上更好。

總之，作為一種廣泛使用的生物技術，用于蛋白質在大腸桿菌中表達和純化的pET-32α（+）載體的構建是快速，廉價和可擴展的。雖然作為原核系統，與真核表達系統相比，它也有其缺點。蛋白質的性質是多種多樣的，很難判斷目標蛋白質是否能夠表達，溶解，具有活性和結晶。因此，包括載體和宿主在內的表達策略的選擇應根據蛋白質的量，純度和活性的要求。