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  • 模板 DNA 質量直接影響 PCR 結果,是 PCR 成功的關鍵之一。根據其檢測對象(組織細胞材料)的不同,有不同的制備方法,常用的材料有石蠟切片、冰凍切片、血細胞、胸腹水等。


    實驗步驟

    1. 10 mm 厚石蠟切片 10~15 張,置入消毒后的 1.5 ml Eppendorf 管中。


    2. 脫蠟 二甲苯 1200 μl,9000 r/min,8 min×3。


    3. 脫水無水乙醇 1200 μl,9000 r/min,5 min×3。


    4. 打開 Eppendorf 管蓋子,將其置于 37℃ 烤箱中干燥 1~2 h。


    5. 加裂解液 100μl,混勻后加 20 mg/ml 蛋白酶 K 15~20 μl,終濃度 10 μg/ml 間隔振蕩,55℃ 烤箱中過夜。


    裂解液配制:1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)2 μl,0.5 mol/L(pH 8.0)EDTA 4 μl,10% SDS(pH 7.2)20 μl,加水至 100 μl。


    6. 觀察裂解液是否清亮,如不清亮,根據組織量補加蛋白酶 K 3~5 μl,繼續消化至裂解液清亮。


    7. 加 500 μl Tris 飽和酚,混合至乳狀。


    8. 10000 r/min 離心 10 min,小心吸取上清液。


    9. 加酚和氯仿各 250 μl,混勻,10000 r/min 離心 5 min,小心吸取上清液。


    10. 加氯仿 500 μl,混勻,10000 r/min 離心 5 min,取上清液。


    11. 加 NaAc(乙酸鈉,3mol/L,pH 6.0)70 μl,無水乙醇 700μl,混勻,-20℃ 保存 2 h。


    12. 10000 r/min 離心 5 min,棄上清液。


    13. 加 70% 乙醇 1 ml,混勻,清洗。


    14. 10000 r/min 離心 3 min,棄上清液。


    15. 開蓋,倒置 Eppendorf 管,室溫下干燥。


    16. 加 TE 緩沖液(pH 8.0)20~40 μl,55℃,10 min 速溶,置于 -20℃ 冰箱中保存。


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