用大腸桿菌Klenow片段標記合成的寡核苷酸實驗

甲酰胺加樣緩沖液 大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 變性聚丙烯酰胺凝膠 寡核苷酸引物 寡核苷酸模板 [α-32P]dNTP

磷熒光粘貼標簽 水浴或模塊

材料

溶液和緩沖液
稀樣貯存液至適當濃度。

甲酰胺加樣緩沖液
10XKlenow 緩沖液

酶與緩沖液

大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段

凝膠

變性聚丙烯酰胺凝膠
丙烯酰胺在凝膠溶液中的比例及電泳條件，依反應混合液中寡核苷酸的大小不同而異，表 10-4 列出一些有用的提示：



聚丙烯酰胺凝膠通常用 lxTBE(89 mmol/LTris-硼酸，2 mmol/LEDTA) 灌制。電泳亦在此緩沖液中進行。聚丙烯酰胺凝膠灌制的方法與操作詳見方案 1 及第十二章的方案 8。

核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物
用方案 1 所述方法純化引物。為確保有效地標記，反應液中引物濃度應 3~10 倍摩爾過量于 DNA 模板。

寡核苷酸模板
用方案 1 所述方法純化寡核苷酸模板。寡核苷酸模板的序列應與所需的放射性標記探針的序列互補。

放射性化合物

[α-³²P]dNTP
為保持反應底物的高濃度，應在盡可能小的體積中進行鏈延伸反應因此，最好使用溶于乙醇-水中的放射性標記 dNTP, 而不是溶于緩沖的水溶液中。適量體積的醇溶 [α-³²P]dNTP 可在即將用于標記反應的微量離心管中混合及揮發干燥。為最大限度減少前體化合物及探針的放射分解，盡可能在 [³²P]dNTP 到達的當天進行探針的放射性標記。

專用設備

磷熒光粘貼標簽（有商品供應）或極熱級放射性墨水粘貼標簽放射性墨水是由少量 ³²P 與防水黑色繪圖墨水混合而成。在本方案中使用的墨水為“極熱級”（手提式小型探測器計數大于 2000cps), 用一纖維尖筆將墨水點于粘貼標簽上。應在纖維尖筆上貼上放射性物質專用標志膠帶，妥善保管。化學發光標簽可替代放射性墨水，可以從 Stratagene(Glogos) 公司購買。
這種標簽可反復使用多次，但在下一次放射自顯影前須用熒光照射。

預溫至 80°C 的水浴或模塊。

附加試劑

本方案步驟 9 所需要的試劑列于第 5 章的方案 12。

方法

1. 計算出能達到比活度的要求及足以使全部模板鏈完全合成所需的 [α-³²P]dNTP 量，將其加入微量離心管中（參見本方案的概述)。
在反應的任一階段，dNTP 的濃度都不能低于 1umol/L 為保持反應底物的髙濃度，應在盡量可能小的體積中進行廷伸反應。

2. 在離心管中加入適量的寡核苷酸引物和模板寡核苷酸。
為確保有效的放射性標記，反應液中引物的濃度應 3~10 倍摩爾過量于模板 DNA。

3. 加入 0.1 體積的 10X Klenow 緩沖液，充分混勻。

4. 按每 5ul 反應體積 2~4 單位加入 Klenow 片段，充分混勻。14°C 下溫育反應 2~3 h。
如有必要，反應過程中可取出小置（0.1ul) 樣品，測定可被 10% 三氯乙酸（TCA) 沉淀的放射性的比例來監測反應的進程（參見附錄 8)。

5. 用等體積甲酰胺加樣緩沖液稀釋反應混合液，于 80°C 加熱 3 分鐘，然后將全部樣品加至變性聚丙烯酰胺凝膠。

6. 電泳結束后，卸下電泳裝置，將聚丙浠酰胺凝膠黏附于一側的玻璃上（詳細操作見第 12 章的方案 11)。
警惕：未摻入的 [α-³²P]dNTP 可能遷移到下層電泳糟中，使其帶有放射性。此時應將凝膠、玻璃板、緩沖液及電泳裝置均作為放射源處理。應在聚異丁烯酸樹脂防護屏后謹慎處理。

7. 將凝膠及其背面的玻璃板一起包裹于 Saran 包裝膜內，記下指示染料的位置，用手提式小型探測儀檢測凝膠上含寡核苷酸區域的放射性活度。在樣品的邊緣的包裝膜上粘貼一組放射性墨水或磷光圓點標簽，并用 Scotch 膠帶覆蓋放射性標簽，以防放射性墨水污染膠片夾或增感屏。

8. 將凝膠在放射自顯影膠片上曝光（見附錄 9)。
通常摻入探針的放射性活度甚高，獲得膠片圖像的時間僅需數秒。

9. 膠片顯影后，將放射性墨水的影像和放射性標簽重疊，以定位探針在凝膠上的位置。切下條帶，按第 5 章的方案 12 所述方法回收放射性標記的寡核苷酸。