用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段標記雙鏈DNA的3’端

限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段模板 DNA

乙酸銨乙醇dNTP 溶液

Sephadex G-50 離心柱水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙酸銨（10 mol/L )

乙醇

2. 酶和緩沖液

適宜的限制性內切核酸酶

大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

3. 核酸和寡核苷酸

含適當未標記的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液

模板 DNA ( 0.1~5 μg )

4. 放射性復合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性為 800~3000 Ci/mmol）

5. 專用設備

Sephadex G-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

預先設定至 75℃ 的水浴

二、方法

1. 在 25~50 μl 的適當的限制酶緩沖液內，用所需限制酶消化高達 5 μg 模板 DNA。

2. 向完成的限制酶消化反應中，加入：

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP        
（比活性 800~3000 Ci/mmol）     2~50 μCi
未標記的 dNTP                           至終濃度為 100 μmol/L
Klenow 片段                               1~5 單位

室溫溫育反應 15 min。

3. 于 75℃ 加熱 10 min 以終止反應。

4. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的 DNA 與未摻入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸銨存在下進行兩輪乙醇沉淀。