實驗方法原理 可用甲酰胺代替 SDS/蛋白酶 K 將純化的噬菌體顆粒去除外殼。這種方法雖然不是很有效,但在某種意義上它比以前的操作方法更快。
實驗材料 限制性內切核酸酶λ 噬菌體顆粒
試劑、試劑盒 EDTA乙醇甲酰胺NaClTETris-Cl
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠硼硅酸鹽巴斯德吸管
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0)
乙醇
甲酰胺,去離子
NaCl ( 5 mol/L)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
Tris-Cl ( 2 mol/L,pH 8.5)
2. 酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠(0.7%),用 0.5X TBE,含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 專用設備
硼硅酸鹽巴斯德吸管(密封)或 Shepherd 鉤
5. 載體和菌株
λ 噬菌體顆粒
二、方法
1. 如果必要,按方案 11 步驟 1~4 所述將 CsCl 從噬菌體顆粒樣品中除去。
2. 測定噬菌體顆粒樣品的體積。
3. 加入 0.1 倍體積的 2 mol/L Tris ( pH 8.5)、0.05 倍體積的 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)和 1 倍體積的去離子甲酰胺,37℃ 溫育 30 min。
在溫育過程中,牛奶狀的噬菌體顆粒懸浮液變清成透明溶液。
4. 加入 1 倍體積(等于步驟 3 中的終體積)的 H2O 和 6 倍體積(每倍體積等于步驟 3 中的終體積)的乙醇。
5. 將 λ 噬菌體 DNA 沉淀黏附于封口的硼硅酸鹽巴斯德吸管或 Shepherd 鉤的末端,轉移至含 70% 乙醇的微量離心管中。
6. 短暫離心(10 s ) 收集 DNA 沉淀。
避免長時間的離心,否則將使 DNA 太緊密而難以溶解。
7. 去上清,將離心管打開于實驗臺放置數分鐘以便使乙酵揮發。加入 300 μl TE,通過拍離心管壁使潮濕的 DNA 沉淀重新溶解。盡量避免使用渦旋振蕩。
8. 加入 6 μl 5 mol/L NaCl 和 750 μl 乙醇重新沉淀 DNA,收集沉淀,如步驟 6 和 7 所述重新溶解。
9. 采用適當大小的分子質量標準,經 0.7% 瓊脂糖電泳分析未消化的或已用適當限制酶切割的部分 DNA(0.5 μg),檢査噬菌體 DNA 的完整性。
10. 將噬菌體 DNA 于 4℃ 保存。