| 實驗步驟 |
第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10mmol/L)
DTT(0.lmt)l/L)
TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5,1 mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和緩沖液
反轉錄緩沖液，5X(制造商提供）
RNA 酶 H
RNasin
SuperScriptII 逆轉錄酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
GSP-RT 引物（100ng/ul)
poly(A)+RNA 或總 RNA
4. 特殊設備
預設為 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加熱儀
二、方法
1. 在一個無菌的離心管中，于冰浴上混合以下轉錄成分。
反轉錄緩沖液，5X 4ul
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10 mmol/L) 1ul
DTT(0.lmol/L) 2ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2. 在另一個管中，混合 0.5ul 的 GSP-RT 引物（100ng/ul) 和 lug poly(A)+RNA 或5ug 總 RNA，再加 13ulH20。80°C 溫育 3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s。
3. 將 RNA/引物混合物加入到反轉錄成分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆轉錄酶，溫和混勻，42°C 保溫 1h，然后 50°C 保溫 10min。
4.70°C 溫育 15 min，使逆轉錄酶失活，然后離心 5s。
5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H 到管中，37°C 溫育 20 min, 以破壞 RNA 模板。
6. 用 TE 將反應混合物稀釋至 40ul，4°C 保存（這就是 5'末端無尾 cDNA 文庫）。
第 2 階段：在第一鏈 cDNA 產物末端加 poly(A) 尾
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
CoCl2(25 mmol/L)
dATP 溶液（1mmol/L)
TE(10 mmolTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
脫氧核苷酸末端轉移酶（Tdt)
加尾緩沖液，5X(125 mmol/LTris-HCl、pH6.6，lmol/L 二甲胂酸鉀，1250ug/ml BSA)
3. 特殊設備
Microcon-100 過濾器（Millipore) 或起相同作用的其他產品
預設為 37°C、65°C 的水浴或加熱儀
二、方法
1.
用 Microcon-100 過濾器（Millipore) 或起相同作用的其他產品，去除 5'末端無尾cDNA 文庫（由上面第 1 階段第 2
步得到）中的過量引物，按說明進行操作，并用 TE 洗兩次以上，總體積不要超過 15ul，用水將總體積調整至 15ul。
2. 加 4ul 的 5X 加尾緩沖液和 10U 的 Tdt。
3.37°C 保溫 5 min, 然后 65°C 溫育 5 min。
4. 用 TE 將體積稀釋至 500ul, 保存于 4°C(這就是 5'末端加尾 cDNA 文庫）。
第 3 階段：擴增
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)
HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X)
3. 核酸和寡核苷酸
5'末端加尾的 cDNA 庫（由上面第 2 階段得到）
寡核苷酸引物 Qo、QT 和 GSPl(Q0 和 QT 的序列見圖 25-2)
4. 特殊設備
可設程序的熱循環儀
二、方法
1. 第一輪
(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中混合以下成分。
HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
Hercules Hot-Start 聚合酶 2.5U
H20 至 50ul
(2) 加 1ul 的 5'末端加尾 cDNA 文庫（來自第 2 階段第 4 步）和 GSP1,Q0[見圖 25-2(b)] 和 QT 引物各 25pmol。
(3) 混勻并在 DNA 熱循環儀上 98°C 加熱 5 min, 使第一鏈產物變性，并激活聚合酶。冷卻至 48°C 退火 2 min, 然后 72°C 延伸 40 min。
(4) 按下列程序進行 30 個擴增循環。
2. 第二輪
(5) 取出部分第一鏈擴增產物，用 TE 以 1:20 稀釋。
(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 mm 的延伸步驟，用 Q1 引物和 GSP2 引物擴增 1ul 上述稀釋材料。
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