用高靈敏度LC／MS分析血液中藥物小分子的訣竅

  影響LC/MS實驗結果的因素較多，那么在保證系統運行基礎上如何保證高靈敏度的實驗結果?本文將從兩個方面來進行分析。

　　前言

　　隨著生活水平的提高，人類的關注重心已經從溫飽問題轉移到更高的追求：精神水平的提升和個人生命的長度。增加人類壽命，勢必要克服各種各樣疾病的困擾。現代醫學的研究重心在于盡早發現和精準治療，表現為生命體中生物標記物(Biomarker)的濃度水平和治療藥物的代謝過程等研究。

　　目前，醫院臨床實驗室中的特定診斷通常使用免疫檢測和分子檢測手段，交叉反應和干擾較為嚴重;作為替代手段，LC/MS基于色譜和質量選擇性對化合物進行分離，靈敏度更高;可有效監控治療藥物，節省時間和成本。

　　影響LC/MS實驗結果的因素較多，那么在保證系統運行基礎上

　　如何保證高靈敏度的實驗結果呢?

　　本文將從前處理和溶劑這兩方面來考慮，下面請看詳細說明。

第一方面：前處理

　　在LC/MS分析中，干擾物與分析物共流出，會影響液滴形成或引起共電離等問題，造成分析物離子化水平不穩定。

　　血液中磷脂類化合物是分析生物樣品時，造成離子抑制的一個主要原因：

　　磷脂類化合物結構

　　傳統的血液前處理方法，包括蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取存在或多或少的局限性，如只能沉淀克級蛋白和與目標分析物共萃取等。

　　默克全新的固相萃取產品HybridSPE^?-Phosphorlipid，基于物理和化學作用，可同時有效去除血液中的蛋白和磷脂，提高液質檢測的靈敏度。

　　HybridSPE^?產品

　　96孔板規格的HybridSPE進行“仿真沉淀”：

　　維生素D及相關代謝物的LC/MS實驗
 

　　維生素D可以促進兒童骨骼增長，降低老年人骨質疏松等。維生素D缺陷，自發現以來，一直是研究重點。維生素D以兩種形式存在：維生素D₂和維生素D₃，兩者在肝臟中進行代謝。

　　其中25-羥基類代謝產物濃度水平，可用于維生素D相關疾病的診斷依據。最近研究表明，將非活性的3-epi維生素代謝產物與其他代謝產物分離開，更有助于疾病研究。采用LC/MS對代謝產物濃度研究的關鍵，在于血液中相關蛋白的去除。

　　維生素D及相關代謝物的結構和分子量信息

　　維生素D及相關代謝物在色譜柱Ascentis Express F5(150 x 2.1 mm, 2.7 μm)上的分離

　　維生素D及相關代謝物經不同前處理方法得到的回收數據對比

通過以上數據實驗數據可看出，基于AscentisExpress F5色譜柱的選擇性，可建立一個快速有效的LC/MS方法，用于體內維生素D代謝物的研究。采用HybridSPE^?，對血液樣品進行處理，去除其中的磷脂和蛋白，可有效提高分析方法的重現性、穩定性和回收率。

　　第二方面：溶劑

　　溶劑等級不同，其所含有的雜質含量不同， LC-MS分析時會產生不同的基線背景和噪音，影響檢測的靈敏度：

　　通過注射泵將兩種不同級別的乙腈直接注射入MS系統

為保證高靈敏度的LC/MS分析，需采用高級別的溶劑，以利血平測試作為示例。

　　將利血平標準品通過注射泵注入MS系統，將所得的信號強度與背景噪音強度進行比較：

　　不同等級溶劑下得到的利血平LC/MS圖譜

　　對利血平的分子離子峰的信噪比進行計算：

　　不同等級溶劑下得到的利血平分子離子峰信噪比值

利血平分子離子峰信噪比值結果表明，采用超梯度級的乙腈，所得到的信噪比值不僅高于梯度級乙腈得到的結果，而且明顯高于其他兩個品牌LC/MS溶劑測得的信噪比值。

　　結論

　　為保證高靈敏度的LC/MS分析結果，可從兩方面著手：

　　1、前處理方面-采用HybridSPE?對樣品中的磷脂和蛋白進行高效去除，可以為液質分析帶來兩個好處：

　　1)操作簡便，節省LC-MS分析時間;

　　2)回收率高，結果重現性更好，更可靠。

　　2、溶劑方面-采用超梯度級的乙腈，可以降低LC/MS分析中的背景值，提高分析峰信噪比。