用T7噬菌體啟動子在大腸桿菌中表達克隆基因實驗

大腸桿菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)pET 載體或同類載體陽性對照質粒

考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液IPTGSDS 凝膠加樣緩沖液SDS-聚丙烯酰胺凝膠靶基因或 cDNA 片段NZCYM 瓊脂平板NZCYM 培養基

SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭沸水浴

材料

緩沖液和溶液

貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄1。
貯存液稀釋至適當濃度。

考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液
參見附錄8。

IPTG(1mol/L)

1XSDS凝膠加樣緩沖液
不含DTT的1xSDS加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT貯存液現用現加于上述緩沖液。

凝膠

SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄8。

核酸和寡核苷酸

靶基因或cDNA片段

培養基

含氨芐（50ug/ml）的 NZCYM 瓊脂平板
含氮芐（50ug/ml) 的 NZCYM 培養基

離心機和轉頭

SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭

特別配備

沸水浴

補充試劑
本方案步驟 1 需要第 8 章方案 7 中所列試劑。
本方案步驟 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列試劑。
本方案步驟 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列試劑。
本方案步驟 4 需要第 12 章方案 3 中所列試劑。

載體和細菌菌株

大腸桿菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)

pET 載體或同類載體
此系列載體請査閱 Novagen 公司目錄（或網址 www.novagen.com)。

陽性對照質粒（如表達已知大小融合蛋白的 T7 噬菌體載體)

方法

含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建

1.PCR 修飾或限制性內切酶消化分離 DNA 片段，片段 5' 端和 3' 端帶有與 T7 噬菌體啟動子表達質粒（如 pET 載體；Studier et al.1990) 對應的限制酶位點。
為確定擴增反應沒有引入錯誤突變，應對 PCR 產物進行序列分析。
必要時可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入強的核糖體結合位點。

2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段與表達載體連接（第 1 章方案 17 或 19)。

3. 連接產物轉化大腸桿菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3）。將轉化體鋪于含氨芐 (50ug/ml) 的 NZCYM 平板，于 37°C 過夜培養。
空的表達質粒轉化相同的大腸桿菌菌株作陰性對照。

4. 通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插入片段的轉化體（請參見第 12 章方案 3)。

誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體。

5. 對照菌和重組菌分別挑取 1~2 個菌落，接入 lml 含氨芐青霉素（50ng/ml) 的 NZCYM 培養液，37°C 培養過夜至飽和。

6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 NZCYM 培養液，在 50 ml 搖瓶中于 37°C 培養 2 h。

7. 吸出 lml 未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟 9 和 10 所述進行處理。

8. 在剩余培養物中加入 IPTG 至終濃度 1 mnol/L，20~37°C 繼續通氣培養。
有些系統的 T7 噬菌體 RNA 聚合酶的表達受熱誘導的啟動子調控，而不是 IPTG 誘導的啟動子。影響誘導表達的因素請參見方案 1 步驟 8 的注解。

9. 在誘導的不同時間（如 0.5、1、2 和 3 h) 取 1 ml 樣品放于微量離心管中，測定 A550，室溫高速離心 1 min。

10. 沉淀懸于100ul lxSDS 凝膠加樣緩沖液，100°C 加熱 3 min, 室溫高速離心 1min, 冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。

11. 樣品加熱至室溫，取 40ug 或相當于 0.15OD550 培養物的懸液上樣于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠。

12.8~15V/cm 電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。

13. 考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶（見附錄 8)。
未轉化的大腸桿菌細胞和轉化了空載體的細胞，蛋白帶形應該沒有區別。誘導一定時間的重組菌應有一條與預計大小一致的帶。

大量表達靶蛋白

14. 挑取重組和對照大腸桿菌菌落分別接入 50 ml 含氨芐（50ug/ml) 的 NZCYM 培養液，在 250 ml 搖瓶中于 37°C 過夜培養。

15. 取 5~50 ml 過夜培養物接入 450~500 ml 含氨芐（50ug/ml) 的 NZCYM 培養液，在 2L 搖瓶中于 37°C 振蕩培養至對數中期（A₅₅₀=0.5~1.0)。

16. 以預試驗確定的最佳 IPTG 濃度、最佳時間和最佳溫度誘導表達靶蛋白。

17. 誘導適當時間后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 從轉頭）離心 15 min 收集細胞，繼續后面的純化方案：

? 如果表達的是 GST 融合蛋白，繼續方案 5

? 如果表達的是麥芽糖結合蛋白融合蛋白，繼續方案 6

? 如果表達產物帶有組氨酸標簽，繼續方案 7