甲基化芯片在表觀遺傳學中的應用

表觀遺傳改變可以定義為基因的遺傳性或獲得性改變，但是這種改變和DNA序列改變無關。DNA甲基化是最為常見的表觀遺傳改變；啟動子或第一外顯子CpG島中的甲基化改變將導致基因表達失活；組蛋白的化學修飾也可以作為表觀遺傳改變；組蛋白發生乙酰化改變的基因通常被開啟。

CpG島的異常甲基化是導致基因沉默和過度表達的最主要的改變，常規的方法不能在全基因組水平上對甲基化進行檢查。表觀遺傳分析與基因芯片技術結合起來則可以高通量進行甲基化的定性、定量分析。

目前建立了2種基于芯片的甲基化分析方法：一個是甲基化特異寡核苷酸芯片(methylation specific oligonucleotide arrays，MSO)方法，另一個是差異甲基化雜交法(differential methylation hybridization method，DMH)。第一種方法利用直接雜交原理，只是在標記前先用亞硫酸氫鈉處理DNA，從而使所有未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶并不受該處理的影響，仍舊為胞嘧啶。這種方法一般針對已知個別基因的調控區進行研究，不能對大量基因尤其是未知基因的甲基化分析。

DMH法是一種嶄新的方法，為大規模研究CpG島甲基化譜提供了高通量的技術平臺。DMH法和表達譜基因芯片類似，只是靶基因和探針制備方法比cDNA表達譜芯片更復雜。DMH方法最初是基于CpG島(CGl)文庫建立的。Cross等構建了含有甲基化CpG結合域的親和基質(affinity matrix)，從人類基因組DNA中分離出CpG島序列。限制性內切酶MseI能將DNA消化為小片段，但是對絕大部分CpG島序列沒有作用。用親和柱將富含GC的MseI處理片段分離出來，克隆人載體中構建文庫。預先篩選CpG島克隆使之具有多個BstUI酶切位點，擴增后的片段用于芯片的制備。從實驗樣本中提取基因組DNA，用MseI處理。酶切后的探針能夠和CGI文庫中的Mse工處理靶基因結合。酶切后的富含GC的片段接上接頭(1inker)，然后用甲基化敏感性內切酶BstUI處理，BstUI處理的和未處理的對照DNA進行linker—PCR和熒光標記。以后的雜交、圖像和數據處理過程與表達譜芯片完全一樣。

最初，DMH應用于尼龍膜對人類乳腺癌細胞系中的CpG島進行分析，后來被應用于玻璃芯片以提高檢測通量。在對乳腺癌的表觀遺傳學改變分析中發現，CpG島的過甲基化可以導致抑癌基因的沉默，以及在一些細胞表現下調。通常，低分化的腫瘤組織比中度分化或分化良好的正常組織表現更高的甲基化程度。

DMH已經成功應用于檢測卵巢癌的甲基化譜。較之卵巢癌細胞系，在卵巢癌組織樣本中可見更多的甲基化CpG島。Ottaviano等通過評估位于人ERa基因第1個外顯子的CpG島甲基化狀態，鑒定了MS()策略的可行性。MSO芯片實驗結果和傳統的DNA印跡和亞硫酸鹽序列分析甲基化的方法結果一致。Rober等用這個技術研究腫瘤抑制基因p16的啟動子區域，這個基因在許多腫瘤中高甲基化。這個啟動子的高甲基化抑制了p16的轉錄，與一些腫瘤相關；他們發現p16的啟動子區域在H1299細胞株的CpG位點均一的甲基化。

不同的甲基化譜反映了腫瘤的不同階段或不同類型。CpG島的高甲基化位點與腫瘤發生相關，因此可以作為特定腫瘤亞型獨特的后天標記。因此，就像基因表達譜，基于甲基化譜的聚類分析也可以用于分析腫瘤的亞型。這些基礎研究具有潛在的應用價值，應用研究的方向包括對腫瘤相關的DNA甲基化模式為基礎的輔助診斷方法的研發和通過抑制腫瘤細胞的DNA甲基化的或組蛋白去乙酰基化的方法及藥物來治療腫瘤。