甲醇芽孢桿菌合成生物學使能技術獲進展

近日，中國科學院天津工業生物技術研究所研究團隊開發了一套甲醇芽孢桿菌合成生物學使能技術：包括高效DNA電轉化方法、基于熱穩定CRISPR-Cas9系統的基因組編輯技術、用于基因穩定表達染色體中性位點，以及用戶友好生物設計工具。團隊利用該工具包解析了甲醇芽孢桿菌，質粒依賴型甲醇代謝遺傳機制等基礎科學問題，構建了無質粒、表型穩定的工程底盤，并通過改造底盤實現了以甲醇為唯一碳源生產L-精氨酸。

團隊研究優化了甲醇芽孢桿菌DNA電轉化方法，將轉化效率較原方法提升1000倍，為遺傳操作奠定了基礎。研究進一步通過比較不同熱穩定CRISPR-Cas9系統的PAM在甲醇芽孢桿菌基因組上的數量和分布，選擇ThermoCas9進行基因編輯測試。結果表明，該系統具有超過98%的靶向致死率，使用1kb同源臂能夠實現高效基因組敲除，敲除4kb以內片段效率接近100%，實現了40kb大片段敲除以及雙基因同時敲除。

研究利用該系統，敲除了甲醇芽孢桿菌內源質粒pBM19和pBM69，以及染色體上的甲醇代謝基因拷貝，并剖析了它們在甲基營養和限制性修飾中的生理功能。結果表明，pBM19質粒攜帶6個甲醇代謝基因，質粒敲除菌完全喪失了在甲醇無機鹽培養基中生長的能力，而攜帶限制性內切酶BmeTI的pBM69質粒敲除菌可以提高無m6A甲基化質粒轉化效率。研究發現染色體拷貝的3-己酮糖-6-磷酸合成酶編碼基因hps、6-磷酸-3-己酮糖異構酶編碼基因phi，以及磷酸果糖激酶編碼基因pfk的單敲除菌株幾乎完全阻斷了甲醇代謝，表明染色體拷貝的基因對甲醇代謝的重要性。

團隊鑒定和評估12個用于基因穩定整合和表達的染色體中性位點。發現它們在不同條件下對菌體生長影響較小，具有不同表達水平，為基因表達精細調控提供了廣泛選擇。研究將對甲醇代謝至關重要的19kb大質粒pBM19整合至中性位點進行表達，同時敲除內源質粒，獲得了無質粒新型工程底盤。該底盤通過適應性進化，展現出穩定且強健的生長特性，避免了質粒丟失風險，也消除了菌株退化隱患。

研究利用該模型模擬預測了甲醇芽孢桿菌代謝甲醇合成L-精氨酸的代謝途徑，并通過基因敲除和過表達研究了L-精氨酸合成調控機制，構建得到利用甲醇生產L-精氨酸初代工程菌。

相關研究成果發表在《細胞報告》（Cell Reports）上。研究工作得到國家重點研發計劃和國家自然科學基金等的支持。

甲醇芽孢桿菌的合成生物學使能技術