甲醇酵母表達注意事項1

試驗的注意事項

1、信號肽識別位點的設計

以質粒pPICZαA為例。在利用PCR反應在外源基因兩端引入酶切位點的試驗中。如果質粒pPICZαA雙酶切中丟失了KEX2蛋白酶的酶切位點 Lys－Arg，應該在上游中，增加了編碼Lys、Arg的密碼子AAA、AGA 。酵母細胞膜中中的KEX2蛋白酶是α-factor信號肽的切割酶，它能有效識別酶切位點Lys－Arg，通過對信號肽的切割使基因表達產物釋放至胞外。

2、PCR產物酶切保護堿基的設計

利用PCR轉換酶切位點，通過P3、P4兩引物的擴增在rhEGF的兩端加上XhoⅠ、XbaⅠ的識別位點和5個保護堿基。

根據限制性核酸內切酶的工作原理，內切酶首先需要結合到核苷酸序列上，并在上面進行滑行，直至識別到酶切位點，為了能使內切酶有效的結合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR進行酶切位點轉換的時候，通常應在5'端限制酶位點外再加3個保護堿基GC，防止引物合成中因為合成效率和純化問題而導致的酶切位點的殘缺。

核苷酸保護堿基之為了保證限制型內切酶的工作效率，在其識別位點的兩側應該保證一定的旁側序列，換言之，識別位點是限制型內切酶識別并特異性切割底物的必要而不充分的條件。鑒于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶領域的總體研究水平和對保護堿基方面的獨到理解，在設計引物時可以參照NEB公司的產品目錄后面的附錄：Cleavage to the end of DNA fragments進行，但是，一些不常用的酶或雖有推薦的保護堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設計保護堿基。本次實驗中，根據美國基因動力實驗室文獻的報道；XbaI、NheI和SpeI位點5’端保護堿基須在5個左右才容易被酶切割，以及一些前人的經驗總結，我們在設計引物時在識別位點5’端，設計了5個保護堿基。以保證較高的酶切效率。

3、高保真DNA聚合酶的使用

Vent DNA聚合酶是從高溫嗜熱菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高溫 DNA聚合酶，能糾正 DNA擴增中產生的錯誤，而傳統的Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶及其變體 AmpliTaq，KlenTaq等都無3’至5’糾錯功能，因此在擴增時出現堿基錯配的機率為 2.1x104。這對于大批量的PCR產物而言，并不是十分嚴重的問題，因為又同樣錯誤的DNA分子僅占全部合成的DNA分子群體的極少一部分。但是，如果PCR擴增的DNA片段是用于分子克隆，那么這就是件值得重視的事情，因為此種分子含有一個或數個錯誤摻入的核苷酸，那么在該克隆中的所有克隆DNA都將帶有同樣的“突變”。將會導致嚴重的后果。

具有校正功能的 DNA聚合酶還有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出錯率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍。在本論文中，為了減少hEGF 在 PCR過程的錯誤擴增，在人工合成hEGF的過程中使用了Vent DNA聚合酶。

隨著PCR技術的不斷發展成熟（擴增長度、保證性、產量和特異性等），質粒構建過程的大多數細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。

4、密碼子的偏好性的原則

酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分析外源基因表達的規律有重要意義,也為改造外源基因或改造宿主細胞提供依據。

5、線性化及采用電轉化的原因

在pPICZαA-EGF電轉整合入GS115的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制性內切酶SacⅠ進行線性化的處理。

細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環狀質粒之間發生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的：

（1）防止隨機插入重組時質粒在功能區斷開，造成目的基因表達失活；

（2）讓同源重組以指定的方式發生。